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一、概述 真菌可以在多个组织系统引起感染。国外的一个文献报道显示，假丝酵母菌在血液、中枢系统、眼、呼吸系统、皮肤和黏膜、全身尿液里均可发现；新型隐球菌除了假丝酵母所在的所能存在的组织系统外，它还可在骨髓里面；霉菌较常见在后面六种组织系统中存在；双相型真菌跟假丝酵母菌一样除骨髓其它组织系统均能存在。 由侵袭性真菌病引起的感染预后较差、死亡率高。 侵袭性真菌病是指真菌侵入人体的组织血液，并在其中生长繁殖，所致组织的损害器官功能障碍炎症反应的病理改变及病理生理的过程。如侵袭性念珠菌感染的病死率是 10-49% ，侵袭性曲霉菌感染的病死率为 62-85% ，侵袭性镰刀菌病感染的病死率高达 79-81% 。 临床显示早期治疗可显著降低患者的死亡率。 目前临床培养的真菌，如尿培养或痰培养的真菌，光从培养来说无法分清是定时的还是感染的细菌。据报道， 50% 的念珠菌菌属症的病人，血液培养是培养无效， 90% 的曲霉菌病人血液培养培养不出来。传统的培养方法不能够满足临床工作的需要，因此就需要增加其它检测的技术，这些技术在诊断侵袭性真菌病的应用中发挥着越来越重要的作用。 二、真菌抗原检测 （一） G 试验 1 、原理 G 试验检测的是真菌的细胞壁成分 ---1,3- β -D- 葡聚糖（ BG ），人体的吞噬细胞吞噬真菌后，能持续释放该物质，使血液中含量增高。 定植时 BG 很少释放入血，因此可有助于鉴别真菌侵袭与定植。 2 、临床价值 1 ,3- β -D 葡聚糖为真菌细胞壁成分 , 适用于除隐球菌和接合菌（毛霉菌）外的所有深部真菌感染的早期诊断，尤其是念珠菌和曲霉菌，但不能确定菌种。 诊断侵袭性真菌感染（如侵袭性念珠菌病、侵袭性曲霉菌病、肺孢子菌肺炎等）的方法之一。 3 、检测方法 （ 1 ） Fungitec G test 阳性阈值为 20ng/L ； 敏感性 67-100% ； 特异性 84-100% 。 （ 2 ） Glucatell test 阳性阈值为 60ng/L 或 80ng/L ； 敏感性 70-80% ； 特异性 90% 左右。 4 、假阳性 （ 1 ）使用纤维素膜进行血透，标本接触过纱布或其他含有葡聚糖的材料； （ 2 ）静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品； （ 3 ）标本中存在脂多糖； （ 4 ）操作者处理标本时存在污染； （ 5 ）使用多糖类抗癌药物； （ 6 ）放化疗造成的黏膜损伤导致食物中的葡聚糖或定植的念珠菌经胃肠道进入血液； （ 7 ）服用多粘菌素 , 厄他培能 , 头孢噻肟、吡肟 , 磺胺也会不同程度引起假阳性。 5 、假阴性 （ 1 ）隐球菌具有厚壁包膜，生长缓慢，导致假阴性； （ 2 ）局灶性曲菌病， BG 很少释放入血； （ 3 ）抗真菌药物的使用。 6 、优势和局限 （ 1 ）优势 ①鉴别侵袭性感染与定植； ②不受机体免疫状态影响，早于临床诊断平均 4 天； ③是早期真菌感染的敏感生物标志。 （ 2 ）局限 不能区分真菌的种类。 （二） GM 试验 1 、原理 GM 试验检测的是半乳甘露聚糖（ glactomannan ， GM ），主要适于侵袭性曲霉菌感染的早期诊断。 半乳甘露聚糖是广泛存在于曲霉和青霉细胞壁的一种多糖，菌细胞壁表面菌丝生长时，半乳甘露聚糖从薄弱的菌丝顶端释放，是最早释放的抗原。 检测法是一种微孔板双抗体夹心法，采用小鼠单克隆抗体 EBA-2 ，检测人血清中的曲霉菌半乳甘露聚糖。 2 、临床价值 （ 1 ）曲菌定植时极少释放入血，因此有助于鉴别侵袭与定植； （ 2 ） GM 释放量与菌量成正比，可以反映感染程度； （ 3 ）连续检测 GM 可作为治疗疗效的监测； （ 4 ）在造血干细胞移植患者中的诊断敏感性高。 （ 5 ）参考值： I ≥ 0.5 为阳性。 3 、假阳性 （ 1 ）使用使用半合成青霉素尤其是哌拉西林 / 他唑巴坦； （ 2 ）新生儿和儿童（双歧杆菌定植、食用乳制品）； （ 3 ）血液透析； （ 4 ）自身免疫性肝炎等； （ 5 ）食用可能含有 GM 的牛奶等高蛋白食物。 4 、假阴性 （ 1 ）释放入血循环中的曲霉 GM 并不持续存在而是会很快清除； （ 2 ）以前使用了抗真菌药物； （ 3 ）病情不严重； （ 4 ）非粒细胞缺乏的患者。 5 、优势和局限 （ 1 ）优势 ①鉴别曲霉菌侵袭性感染与定植； ②早于临床症状和影像学异常 1 周； ③ GM 诊断侵袭性曲霉感染的敏感度高于 G 试验； ④血清中存在时间较短，可作为疗效监测。 （ 2 ）局限 不能区分曲霉菌的种类。 临床显示，同时测定 G 试验和 GM 试验有助于早期诊断侵袭性真菌感染。 关于肺泡灌洗液是不是能做 GM 试验， 2011 年临床微生物感染杂志上面报道了一篇文章，是比较肺泡灌洗液 GM 试验和血清 GM 试验及 G 试验对重症患者肺侵袭性曲霉菌病的诊断的效度。入组 51 例病人， 9 例是侵袭性曲霉菌病， 4 例确诊， 5 例临床诊断， 3 例肺孢子菌肺炎， 1 例混合侵袭性曲霉菌和肺孢子菌的病人，结果发现在肺孢里面 GM 试验结果跟血清里面非相接近，也就是说 GM 试验是可以用肺泡灌洗液来做 GM 试验。 肺泡灌洗液（ BAL ），是侵袭性肺部真菌感染重要的检测方法；比血清 GM 试验具有更高的敏感性；结果的判定尚无定论，界值应该高于血清 GM 试验标准。 （三）隐球菌荚膜多糖抗原 检测血清或脑脊液中的隐球菌荚膜多糖抗原。 方法有乳胶凝集（ LA ）、 ELISA 、侧向免疫层析等。 （四）念珠菌甘露聚糖检测 主要用于检测侵袭性念珠菌病。 标本是血清。由于甘露聚糖从血清中快速清除，因此需重复检测，一般检测 1-3 次 / 周，与 G 试验、 GM 试验非常接近。一过性的或导管相关性念珠菌血症的患者，用这个方法检测时一般为阴性。 三、抗真菌抗体血清学检测 （一）检测对象 检测对象为几种特殊的双相真菌：荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌 / 副球孢子菌以及皮炎芽生菌。 目前医院内开展相对较少，一般高度怀疑是这几种双向真菌引起的感染，才做此试验。 （二）检测方法 1 、酶联免疫试验检测特异性 IgM 和 IgG 抗体及其滴度； 2 、补体结合试验检测抗体及其滴度； 3 、免疫扩散试验检测特异性抗体。 四、分子生物学检测技术 （一）核酸扩增检测技术（如 Real-time PCR 以及 Multiplex PCR ） 目前应用主要是从标本里直接检测真菌，如可以从血、肺泡关系里面检测曲霉菌，可以从血液里面检测念珠菌，可以从肺泡灌洗液肺组织痰里面检测肺孢子菌，还可以从血液组织里面检测侵袭性真菌。这些方法的敏感性和特异性各有不同。 （二）非扩增的核酸检测技术（如 PNA-FISH ） 目前主要是针对于阳性血培养液，原理是使用荧光原位杂交。荧光原位杂交是利用荧光标记的特异核酸肽与细胞内相应的巴基类分子或 2NA 分子进行杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描下，观察荧光信号来确定于特异攀登杂交后，被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或是结合荧光攀登的 DNA 区域或者 2NA 分子的染色体，或其它细胞器类的定位。 核酸肽（ Peptide Nucleic Acid ， PNA ）是一种不带电荷的 DNA 类似的物质。其主链骨架主要是由重复的 N2 氨基乙基甘氨酸一酰胺键联合聚合而成，或剪辑通过亚甲基连接到 PNA 的分子的主链上，所以说 PNA 、 DNA 分子杂交结合力强专业性高。由于没有电荷排斥力，它杂交形成的双螺旋结构的稳定性高。因此目前在血液培养白色念珠菌、近平化念珠菌、光滑假丝酵母菌等，它的敏感性达到 99.3% 以上，特异性达到 100% ，但敏感性依赖于标本中的菌量，菌量越多敏感性越高。 |
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