【原】成功鉴定了控制造血干细胞活性的新分子，在造血干细胞移植和再生医疗方面有了新的见解

2023 年 8 月 8 日

学校法人东京女子医科大学 国立研究开发法人国立国际医疗研究中心 新加坡国立大学 学校法人椙山女学园椙山女学园大学

成功鉴定了控制造血干细胞活性的新分子，在造血干细胞移植和再生医疗方面有了新的见解

东京女子医科大学实验动物研究所的本田浩章教授(该研究所所长)等人的小组，与国立国际医疗研究中心研究所的项目长田久保圭誉等人的小组，新加坡大学的须田年生教授们的研究小组，椙山女学园大学的本山升教授们的研究小组，其他的研究小组共同，鉴定了控制造血干细胞活性的新分子。本研究成果在美国科学院发行的机构杂志《proceedings of the national academy of sciences ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA，PNAS )”的8月8日号上刊登。

重点

・造血干细胞在进行自我复制的同时，分化成血液的各种系统，终生维持造血系统。 关于造血干细胞活性是由什么机制控制的，迄今为止进行了各种各样的研究，但其全貌尚不清楚。

・我们以前制备了先天性缺失了在造血干细胞中发现高表达的表观遗传因子mbt D1/hemp ( mbt domain containing1/ hematopoietic expressed mammalian polycomb )的小鼠 ，发现MBTD1在胚胎期造血干细胞活性中起重要作用( Honda H et al .，proc natl acad sci USA 108，2468-2473，2011 )。 但是，由于这种小鼠在出生后马上就会死于与Klippel-Feil综合征类似的成骨不全，因此成体造血干细胞中MBTD1的功能尚不清楚。

・这次，我们用成体制作了可诱导地缺失MBTD1的小鼠。 造血系统分析发现，MBTD1通过转录因子FOXO3a介导细胞周期调节，同时与多种分子相互作用调节能量代谢，从而调控造血干细胞活性。 我们的研究结果给造血干细胞活性的调控机制带来了新的见解

I 研究的背景和经过

图1

造血干细胞存在于骨髓中，在进行自我复制的同时，分化成红细胞、白细胞、血小板等系列细胞，维持成体造血(图1 )。 在造血系统中，造血干细胞可以通过细胞表面标志物的组合进行定义和分离，分离的造血干细胞用于白血病、骨髓增生综合征等造血器官肿瘤的骨髓移植治疗。 但是，关于造血干细胞活性是通过什么样的机制来维持的，至今为止进行了各种各样的研究，但整体情况还不清楚。

我们关注了在老鼠的造血干细胞中被鉴定出的名为mbt D1/hemp ( mbt domain containing1/ hematopoietic expressed mammalian polycomb )的分子。 该分子具有4个与DNA结合C2C2融合指基和与甲基化组蛋白结合的MBT(malignant brain tumor )结构域，可能是通过表观遗传调控系统(不依赖于DNA序列变化而调控基因表达的系统)调节基因表达(图2 )。  我们以前曾制备过先天性缺失MBTD1的小鼠，发现MBTD1在胚胎期造血干细胞活性中起重要作用( Honda H et al .，proc natl acad sci USA 108，2468-2473，2011 ) 。但是，由于这种小鼠会因与Klippel-Feil综合征类似的成骨不全而出生后立即死亡，因此MBTD1在成体造血中的功能尚不清楚。 为了解决这个问题，我们制作了可诱导后天性缺失MBTD1的小鼠，进行了造血系统的分析。

图2

II 研究内容

造血系统分析结果显示，MBTD1缺失小鼠(以下简称调理基因敲除( cKO )小鼠)与正常小鼠(以下简称对照( Ctrl )小鼠)相比，正常情况下，骨髓中长期骨髓干细胞、短期骨髓干细胞、多能祖细胞等造血干细胞祖细胞的比例较多(图3左)，研究表明，在给药5-Fluorouracil(5-FU )和骨髓移植等应激反应中，造血干细胞表现出异常行为(给药5-FU时增殖过度( 16天)，骨髓移植显示外周血嵌合率降低(1~4个月) (图3右)。

图 3

以检索其原因为目的，从Ctrl小鼠和cKO小鼠中分离了长期造血干细胞，并进行了全面的基因表达分析，在cKO小鼠的造血干细胞中，发现了周期素依赖性激酶抑制因子( cyclin-dependent kinase inhibitor、 CDKI )介导的使造血干细胞停留在静止状态的转录因子FOXO3a的表达下降，实际上在其下游的ckdi p57和p21的表达也有所下降(图4左)，造血干细胞没有停留在静止期，而是过多地进入了细胞周期，这一点已经被证实。 染色质免疫沉淀还表明MBTD1直接与FOXO3a基因的启动子区结合(图4右)。

图4

接下来，我们就cKO小鼠造血干细胞中发现的异常，通过导入活化型FOXO3a能否恢复其表现型进行了研究。 为了达到这个目的，将表达可诱导活化型foxo 3a FoxO3aTM的FoxO3aTM小鼠挂在cKO小鼠上，同时诱导MBTD1缺失和FoxO3aTM的表达，进行造血系统的分析(以下称为cKO小鼠中fox O3 ATM小鼠) 分析结果显示，在Rescue小鼠的造血干细胞中，由于在cKO小鼠的造血干细胞中发现的造血干细胞前体细胞的增加和CDKI的表达降低而导致的过剩的细胞周期突入已经完全恢复(图5右 上)，骨髓移植中外周血嵌合率的下降只恢复了一部分(图5右下左)。 研究表明，造血干细胞的活性不仅受到细胞周期的调节，还受到细胞内能量代谢的调节。 因此，对长期造血干细胞中的ATP浓度和在造血干细胞所处低氧状态下主要负责能量代谢的糖酵解系统的活化指标LDH活性进行了测定，与Ctrl小鼠相比，cKO小鼠的LDH活性明显降低，明确了这些在导入了福克斯O3 ATM的Rescue小鼠中无法恢复(图5右下右)。

图5

为了检索其原因，使用作为造血干祖细胞的细胞株使用的EML细胞，进行了与MBTD1结合的分子的鉴定。 结果，鉴定了此前报告的与MBTD1发生相互作用的、控制组蛋白乙酰化的TIP60复合体分子，即EP400、EPC1、TRPPAP、MRGBP、RUVBL1、RUVBL2，除此之外，还新鉴定了核糖体蛋白RPL17、RPL18、RPS19、热休克蛋白HSPA9、钙结合蛋白Calmodulin和mRNA结合蛋白DDX6。 迄今为止，有报告称RPL17、RPL18、RPS19、HSPA9、Calmodulin对包括造血干细胞在内的干细胞活性很重要，提示MBTD1除此之外，还可能通过与DDX6相互作用调节造血干细胞的细胞内代谢(图6左 ) 。另外，被鉴定为结合分子的蛋白质不仅作为TIP60复合体，还作为Heat shock proteins、mRNA regulators、Ribosomal proteins、Calmodulin等各种功能体进行相互作用，这一点已明确(图6右)。

图6

图7

 根据以上结果，我们假设MBTD1通过FOXO3a-CDKI(p57，p21 )的表达诱导的细胞周期调节，以及可能通过与TIP60复合体和其他蛋白质的相互作用调节能量代谢调节两方面来调控造血干细胞活性(图7 )。

III 今后的发展

  我们通过制造先天性和后天性缺失MBTD1的小鼠，发现MBTD1不仅在胚胎期，在成体中对造血干细胞活性也很重要。 另外，成体通过调节经由FOXO3a的细胞周期和不经由FOXO3a的能量代谢两方面来控制造血干细胞活性。 FOXO3a是包括造血干细胞在内的干细胞细胞周期调节中非常重要的分子，此次的MBTD1首次发现了直接调控其表达的分子。 今后，弄清楚MBTD1通过什么样的机制与目的基因和蛋白质结合并发挥其功能，它们是否与迄今为止显示的其他造血干细胞维持机制合作，控制造血干细胞活性，MBTD1在其他组织干细胞中起着什么样的作用等是很重要的 预计获得的知识将有助于造血干细胞移植和再生医疗。

【用語説明】

表观遗传学:通过对DNA和组蛋白进行甲基化等化学修饰，在不发生碱基序列变化的情况下控制基因表达的结构 给予5-Fluorouracil(5-FU ) :通过给予抗癌药物5-FU诱导骨髓抑制，将处于静止期的造血干细胞导入分裂期 外周血嵌合率:外周血中供体来源的细胞比例 周期依赖性激酶抑制因子:通过抑制细胞周期进程所需的周期依赖性激酶的作用，负调控细胞周期 染色质免疫沉淀:研究蛋白质和DNA相互作用(结合)的方法，使用目标蛋白质的抗体进行蛋白质DNA复合体的免疫沉淀，分析包含DNA的哪个区域 启动子:转录因子复合体结合，转录开始的DNA上的部位

【咨询方式】

<研究相关事项> 东京女子医科大学实验动物研究所所长、尖端生命医学科学专业疾病模型研究领域教授本田浩章(本田浩纪) 邮编〒162-8666东京都新宿区河田町8-1 Tel: [phone]分机42451 传真: [phone] 国立国际医疗中心研究所，生物恒常性项目项目长田久保圭誉( Takobakeyo ) 邮编〒162-0052东京都新宿区户山1-21-1 Tel: [phone]分机2875 <新闻采访相关事宜>东京女子医科大学宣传室 邮编〒162-8666东京都新宿区河田町8-1 tel:[phone]传真: [phone] E-mail: [e-mail] 国立国际医疗研究中心企划战略局宣传企划室 邮编〒162-8655东京都新宿区户山1-21-1 Tel: [phone] E-mail: [e-mail]