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作者：张钊硕，华中农业大学资源与环境学院研究生，主要研究合成菌群的构建与功能。 LorMe周刊每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍对微生物多样性的维持机制的探究，原文于2023年7月发表在《Science》。
 微生物生物多样性的维持机制是生态学的一个关键科学问题。过去关于微生物共存的工作主要集中在物种对上，但尚不清楚在多物种群落中共存的前提是否是成对共存。在这篇文章中，为了研究微生物多样性的维持（共存）机制，研究人员进行了数百次的微生物竞争实验，探究了12个来源于不同生境的、稳定共存的微生物群落中，各个成员之间的相互作用结果。借助于自动图像分析技术，研究人员量化了物种的丰度，并发现竞争排斥是最常见的结果，且具有明显的等级性和传递性。最终，研究证明了多物种共存是群落的一种涌现性现象，与物种在环境中的两两共存并不必然相关。 研究背景针对于微生物群落中多物种共存的机制，研究人员提出了两种可能的观点（图1A）。①一种是还原论的观点，认为两个物种是否能在孤立的条件下共存，决定了它们是否能够在更复杂的群落中共存。这种观点认为如果两个物种在单独培养时会相互排斥，那么它们就不大可能在一个多物种群落中共存。②另一种是整体论的观点，认为共存是一个群体性质，需要其它物种的存在。这意味着，即使两个物种在单独培养时会相互排斥，它们仍有可能在一个多物种群落中共存，因为其它物种会影响它们之间的相互作用。 直接测试上述两种假设在自然微生物群落中通常是不可行的。因为自然群落具有丰富的生物多样性，而人们通常只能分离和竞争少部分共存的物种；并且实验室环境和自然群落原始的栖息环境也存在差异，所以结果必然是不可靠的。因此，本文采用了实验方法在受控的微生境条件下先行构建了来自自然群落的物种对和低多样性的微生物富集群落。因为这些群落是通过在人工合成的环境中培养不同类型的微生物而形成的，而且它们都能够稳定地维持多物种共存，所以可以保证群落和个体在一致的条件下进行研究（图1B）。 具体而言，这些人工合成群落来源于12个土壤和植物微生物组，在以葡萄糖为唯一碳源的M9培养基中静置培养。培养温度为30℃，每48小时通过125倍稀释传代到新鲜的同一培养基中。一共传代了12次，最终得到物种数量＜25个的多个稳定共存的微生物群落。这些微生物群落中主要是肠杆菌科和假单胞菌科的细菌。鉴于此，研究人员可以在这个系统中解构多个稳定的群落，并在相同的起始条件下重建和竞争大多数物种对。如此以来，这个实验系统使研究人员能够评估多物种群落的一部分共存的所有生物对是否也单独共存，从而直接测试群落中的物种共存是依赖于成对的共存还是群落的涌现性特征。
图1.作者利用合成菌群的收敛演化特性搭建了该研究的框架，使得可以在相同的培养条件下得到稳定共存的群落和研究物种对之间的两两相互作用 主要结果多物种富集群落中共存是稳定的 为了确定多物种富集群落的共存是否稳定，文章首先分析了前人研究中已建立群落的群落组装动力学数据，对26个代表性群落的物种（ESV）组成进行了量化【注1】。通过分析微生物群落的组装动态数据，计算了合成微生物种群的入侵适应度以及这些群落中的每个ESV的完整组装动力学【注2】。研究人员发现的绝大多数ESV表现出负频率依赖性选择的特征【注3】。这种选择可以维持微生物群落中的物种多样性，防止任何一种ESV完全替代其他ESV。通过对代表群落ESV的适应度和丰度进行拟合发现，其中大约有96%的ESV其适应度和频率之间为负回归斜率（图1C），即当一个物种的频率增加时，它的相对适合度减少，反之亦然。负回归斜率更说明了负频率依赖性选择的存在。对于那些仅在群落组装期间短暂存在但不存在于最终稳定状态的群落，ESV会随着时间的推移最终消失或者变得极其稀少。从整体的定量分析表明，经过多次稀释和培养后得到的最终稳定群落中，存在一些低频率的ESV，这些ESV具有较高的入侵适应度，即使它们的丰度很低但能可能通过生长和繁殖来补偿死亡损失，并逐渐恢复较高丰度。这些ESV满足了稳定共存的相互隐形标准【注4】，这意味着这些ESV可以从低频入侵，并在多物种富集群落中维持稳定共存。 【注1】：ESV代表"environmental sequence variant"，是指环境序列变体。在研究中，ESV是指通过测序技术获得的环境样品中的微生物序列变体。通过对ESV的分析，可以了解微生物群落的组成和动态变化，从而揭示物种共存和生态系统的功能。ESV的产生可能与细菌多次传代过程中基因的突变和测序产生的错误有关。 【注2】：入侵适应度是指一个物种在特定环境中成功入侵并繁殖的能力。它是指突变体在原有群体中的长期指数增长率。如果入侵适应度是正的，那么突变体的数量可以在原有群体所构成的环境中增长；如果入侵适应度是负的，那么突变体的数量会在原有群体所构成的环境中衰减。入侵适应度使用公式Fi=log(xi/xi–1)来计算。其中，xi表示当前时刻的种群丰度，xi-1表示上一个时刻的种群丰度。 【注3】：负频率依赖性选择是一种进化过程，它指的是一个变异体（相对于其他变异体）的选择价值是它在种群中的丰度（相对于其他变异体）的函数，即它的相对适应度随着它的相对丰度（或频率）的降低而增加。这种选择可以维持微生物群落中的物种多样性，防止任何一种ESV完全替代其他ESV。 【注4】：稳定共存的相互隐形标准要求每个物种的种群数量在低丰度时都能够增长。 为了检验稳定的多物种共存在富集群落中是否是一种成对现象，作者选择了12个具有代表性的群落，通过多次稀释和培养从群落中分离出处于稳定共存状态的ESV，通过对菌株进行基因测序筛选出与ESV之间有足够高的序列相似性的微生物分离株。最终得到了62个分离株，其中40个拥有与群落中ESV完全相同的16S rRNA基因序列，22个有1-4个碱基错配，平均覆盖了稳定合成群落中89.4%的ESV组成（图2B）。 从分离的菌株中随机选择了两个或三个物种进行双物种共培养实验，计算了它们的丰度和入侵适应度（图2A）。入侵适应度是通过菌株的不同初始比例（95:5、50:50、5:95）培养得到的，从而可以判断它们稳定共存的条件。双物种共培养实验条件与合成菌群的培养条件一致（图2A）。不过最终的群落结构组成采用了菌落计数的方法确定（编者注：可能因为足够简单，可以通过菌落形态将不同的菌株区分开来）。为了准确识别共培养实验中不同菌群的丰度，作者开发了一种自动化图像处理流程和机器学习方法，基于筛选出来40个菌落形态特征对共培养图像进行分类（图3）。这种方法使研究人员能够量化两个竞争菌株在共培养中的菌落形成单位（CFU）数量，以确定在共培养中每个竞争菌株的相对丰度。
图2.多物种共存是群落的涌现性特征
图3.自动化图像处理流程和机器学习原理 多物种共存是一种涌现属性在144个竞争对中【注5】：有38对在竞争实验的最后一次稀释周期中，其中一个竞争者无论其初始接种比例如何都被完全排除——这些结果被标记为竞争排除；有65对在竞争实验中，无论其初始比例如何竞争失利的物种频率都下降，表明其发展轨迹趋向竞争排除——这些结果也被添加到竞争排除类别中去（图2C）。因此，总共有103个竞争对在没有其它群落成员存在的情况下无法共存。除此以外，有41对两两竞争并未导致竞争排除，形成了稳定的双物种群落——表明这些成员之间可以两两共存。在这41对中，有29对在八次稀释后的三次竞争实验中都能稳定共存。 为了确定稳定共存的物种对，研究人员要求两个物种都能够从低频率入侵对方【注6】。这一实验证明在稳定多物种群落中，这些共存对具有相互侵略性，并且能够在不同资源中共同存在。这个条件在29对共存对中有21对满足。剩下的八个共存对未满足相互侵略性的准则，因此将其分类为无相互侵略证据的共存对。 在12个不同的富集群落中，有许多稳定共存的物种在两物种共培养时却无法共存，表现出强烈的竞争排斥现象。这说明多物种共存不是由双物种共存决定的，而是由整个群落的涌现属性决定的，即群落中其他物种的存在对维持共存起到了重要作用。 根据上述分析数据得出在12个群落中，至少有一对无法在孤立状态下共存。无论群落的丰富程度如何，表现出竞争性排除竞争对手比例都相似。这些结果与先前论文提出的加性组装规则不一致，该规则只能够预测由能够孤立成对共存的菌株组成的多样性较低的群落的组成。因此，复杂的多物种共存不能简化为群落中的两两关系，并且群落中的这种属性能是整个群落的一种涌现性特征。 【注5】：研究人员在进行成对的竞争实验，共有159对。使用 62 个分离株组建物种对时，其实有 choose(62, 2) = 1891 种不同的组合。这里实际上只有 159 个。这是因为作者考虑了分离株的来源，即只选择了那些来源于同一个菌群的物种对。根据作者在 12 个合成菌群中分别分离得到了 3/3/3/4/4/4/5/5/5/7/9/10 个菌株的情况（图2B），那么理论上有 choose(3, 2) * 3 + choose(4, 2) * 3 + choose(5, 2) *3 + choose(7, 2) + choose(9, 2) + choose(10, 2) = 159 种组合。这个数值是与作者声称的组合数目相匹配的。在实验过程中，由于有6对无论接种频率如何，都没有检测到菌落，因此被排除。另外，还有9对的判定准确度较差（可能是无法通过菌落形态将它们区分开来），也被移除。因此，最终分析中实际仅使用了144个物种对的结果。 【注6】：低频率入侵指的是在竞争实验中，两个物种都能够从较低的初始频率开始逐渐增加其存在量而不会被竞争排除，还可以成功地繁殖并维持自己的种群数量。sign(Dx) = sign[x*–x(T0)]方程用于判断物种是否能够相互侵入，其中sign表示符号函数，Dx表示物种频率的变化，x*表示物种的平衡频率，x(T0)表示实验开始时的物种接种频率。如果 sign(Dx) = 1，表示物种频率的变化（Dx）与物种平衡频率之差（x*–x(T0)）具有相同的符号。这意味着该物种在竞争实验中能够成功侵入对方并保持共存。如果 sign(Dx) = -1，表示物种频率的变化与物种平衡频率之差具有相反的符号。这意味着该物种在竞争实验中无法侵入对方或者无法保持共存。 竞争性排斥是有层次的和可传递的 使用之前的竞争结果，根据每个群落排除的竞争对手数量，对每个群落中的所有分离菌株进行排名（图4A），发现竞争性排斥几乎是有层次的：发现不同ESV之间存在着强烈的竞争关系，这导致一些ESV被其它ESV所排斥或取代。这种层次可能一些ESV在某些条件下受到抑制，而在另一些条件下受到促进而产生的。并且通过实验发现，竞争等级与菌株在葡萄糖培养基中的生长速率呈正相关。 在极端情况下，当共存网络是不可传递时，仍然有可能会出现涌现性共存的现象。然而，在本研究中考察的12个稳定合成群落中，在77个包含的物种三元组（ABC三个物种）没有发现任何一起违反传递性的情况（图4B）【注7】。若将三元组中违反传递性的概率设为1/4的话，则在实验中观测到这一现象的概率P(0)为4.4×10-47。因此，不能认为稳定共存菌群中物种对之间的竞争性排斥是不可传递的。这说明非传递循环不太可能稳定构建群落的共存。 【注7】：传递循环的例子是：如果A排斥B，B排斥C，那么A也应该排斥C。而如果A排斥B，B排斥C，但C排斥A时，就形成了一个非传递循环。
图4.在稳定共存的群落中，物种对之间普遍存在竞争等级。(A) 利用图 2 所示的实验数据，将 12 个群落中的所有分离株根据它们在配对竞争中排除的其它分离株的数量从上到下排序。网络中的灰色节点代表一个分离株。红色箭头从配对竞争中获胜的分离株指向失败的分离株。蓝线连接共存的分离株。(B) N = 77、P = 0.25 的二项分布显示了如果我们随机交换 (A) 中的共存和排斥链接，表现出反向性配对的预期数量。红色圆圈表示实验确定的破坏传递性的三元组数量（这里为零）。 论文信息 原名：Emergent coexistence in multispecies microbial communities 译名：多物种微生物群落中的涌现共存 期刊：Science DOI：10.1126/science.adg0727 发表时间：2023.07 通讯作者：Chang-Yu Chang 通讯作者单位：耶鲁大学生态与进化生物系 |
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