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题目: Emergent coexistence in multispecies microbial communities 期刊: Science, 2023, 381: 343-348 通讯作者: Alvaro Sanchez (alvaro.sanchez@cnb.csic.es); Djordje Bajić (d.bajic@tudelft.nl); Chang-Yu Chang (cychang2@sas.upenn.edu) 第一单位: Yale University 论文链接: https://www./doi/10.1126/science.adg0727   维持微生物生物多样性的机制是生态学研究中十分重要的部分。过去关于微生物共存的工作主要集中在物种对上，尚不清楚多物种共存群落中的微生物是否彼此之间都能够成对共存。关于这个问题，存在着两种观点：一种观点认为多物种共存是基于群落中各成员成对存在之上附加的现象，也就是与群落环境隔离时，群落的所有共存成员必须能够成对共存。另一种观点认为，多物种群落中各物种的稳定共存是群落的一种更复杂的或新兴的属性，是物种与物种、物种与环境相互作用的结果，这些物种能否稳定共存与它们是否能成对共存并无直接关联。为了解决这个问题，本文作者对12个不同微生物富集群落中稳定共存的物种进行了数百次配对竞争试验。作者开发了一个自动图像分析管道来量化物种丰度从而获得实验结果，发现竞争排斥是最常见的结果，并且具有很强的等级性和传递性。由于许多在多物种群落中能够稳定共存的物种无法在相同条件下成对共存，因此得出结论，多物种共存是一种新兴复杂的现象，不能简化为多个能共存的物种对的集合。这项工作强调了群落背景对于理解复杂生态系统共存起源的重要性。    1. 多物种富集群落中的各物种能稳定共存 要验证上述提到的两种观点，首先需要获得一个稳定的多物种富集群落并验证其稳定性。本文作者先将12个土壤和植物的微生物组重新培养在单独含有M9培养基的试管中，以此获得了包含110-1290个ESVs（exact sequence variants，环境序列变体）的细菌物种池。将这12种微生物溶液稀释125倍接种于M9-葡萄糖培养基上，30℃静态培养48 h，再连续传代12次。通过16S rRNA扩增子测序确定不同时间点的群落组成。所有群落均包含多个（N<25）ESVs，主要属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和假单胞菌科（Pseudomonadaceae）（图1B）。因此，在该系统中可以解析多个稳定的群落，并且可以在相同的起始条件下进行物种对的重建和竞争试验。这个试验系统能够评估多物种群落中共存的所有成对生物体是否也能够单独成对共存，从而直接检验共存是成对现象还是新兴现象。 为保证所得到的多物种微生物群落是稳定存在的，通过分析微生物群落的组装动态数据，作者计算了合成微生物种群的入侵适应度以及这些群落中的每个ESV的完整组装动力学，量化了26个代表性群落中每一次转移结束时的所有ESVs频率。除此之外，作者还确定了这些群落中每个ESV在其完整组装动态上的入侵适应性。将适应性和频率进行拟合得到线性回归模型，再与经验观察到的平衡频率相比较，确定了过去四次转移中ESVs的平均频率。相比之下，仅在群落组装过程中短暂存在但不属于最终稳定群落一部分的ESVs通常表现出负平均适应度值或接近0的平衡频率（图1C）。总体而言，定量分析表明，文中所构建的多物种群落满足稳定共存标准。  图1. 富集微生物群落满足物种共存复杂性的测试 （A）关于物种共存的两个观点（B）构建富集微生物群落的试验方法（C）运用频率相关动力学比较拟合值和实测值从而预测平衡频率 2. 成对竞争测定的量化 为了检验稳定的多物种共存在富集群落中是否是一种成对现象，作者在上述实验基础上选择了12个具有代表性的群落，包含5到13个处于稳定平衡状态的ESVs，将它们进行最终转移，然后从每个群落中选择至少3个形态不同的分离菌株。使用Sanger测序，获得了这些分离菌株的16S rRNA基因的全长序列，并将其与在其起源群落中发现的ESVs进行比对，保留了所有具有至少200碱基对共有序列和小于等于4个序列错配的分离菌株。最终得到总共62个分离菌株，40个完全匹配，22个有1-4个碱基错配，平均覆盖了原始群落89.4%的ESVs组成（图1B）。 然后，作者在分离菌株之间进行了所有可能的两两配对竞争试验，将混合成对分离菌株共培养，并在与原始群落富集试验相同的温度（30℃）下，在相同的葡萄糖最小培养基中传代8个生长稀释循环，所有配对竞争试验均进行了三次重复，计算了它们的丰度和入侵适应度（图2A）。在每个生长周期中，菌株以不同初始比例（95:5、50:50、5:95）进行培养，细胞孵育48小时后，将所得培养物稀释125倍至新鲜培养基中。在最后一个稀释周期结束时，通过将两两共培养物涂在培养皿上并计数属于每个分离菌株的菌落（CFU）来测量其组成，从而判断它们稳定共存的条件。 值得注意，本文创新地采用了自动图像处理流程并结合机器学习方法进行菌落形态的识别和分类，避免了人为的主观偏差。 3. 多物种共存是一种新兴的特性 在26.4%的配对（38/144）中，无论其开始接种比例如何，两个竞争菌株中的一个在最后稀释周期结束时被竞争排除（即在板上未检测到菌落），将这些结果标记为竞争性排斥。对于45.1%的配对（65/144），无论其初始比例如何，处于竞争弱势的菌株频率都下降（DF<0），表明这些正朝着竞争排斥的方向发展。除此之外，71.6%的配对（103/144）在没有其他群落成员的情况下无法共存（图2B和C）。这些结果说明，复杂的多物种共存不能简化为群落中的成对关系。 配对竞争试验中，在能够稳定共存的群落中发现了大多数发生竞争排斥的物种对，但是仍存在一部分配对（100.0%-26.4%-45.1%=28.5%，41/144）没有发生竞争排斥，这表明配对共存在稳定多物种群落的物种中仍可能很常见。在这41对中，有29对在8次转移后仍然共存。为了识别那些稳定共存的物种对，作者引入了相互入侵标准，该标准要求两个物种必须能够从低频相互入侵。29个共存对中的21个满足了这一条件。其余8对共存对不满足相互入侵的标准，因此作者将这8对分类为能够共存而没有相互入侵。其余部分（41-29=12，12/144，8.3％）没有提供结论性的结果，将这些保留为不确定（图2B和C）。结果使“复杂的多物种共存不能简化为群落中的成对关系”这一结论更加严谨。  图2. 多物种共存是群落的一个新兴特性 （A）配对试验（B）群落按照每个群落中菌株的数量从最小（3个类群）到最大（10个类群）排序。每个条形图中上面的数字分别表示ESV的数量、分离菌株的数量和测试对的数量（C）144个配对共培养物的竞争结果 4. 竞争排斥具有等级性的和传递性 为了更好地探索成对竞争网络的结构，作者使用了图2所示的竞争结果，根据每个群落排除的竞争对手数量对所有分离菌株进行排名。结果发现，竞争排斥明显具有等级性的：在103对中，两个分离菌株中的一个被排除在外，被排除在外的几乎全都是低等级物种（图3A）。 当共存网络不具有可传递性时，可能会突现能够共存的极端情况。然而，作者发现非传递性循环不太可能使群落稳定共存。在本文12个群落中可以通过竞争排除连接的77个“三物种组”中，作者没有发现任何违反可传递性的情况（图3B）。 有研究表明，当存在空间异质性或者当竞争物种在多个限制性资源上具有差异竞争能力时，非传递性可以使多个竞争物种稳定共存。虽然非传递性的概念在理论上已经得到了很好的确立，但对其普遍性的实证研究却很少。作者对来自12个群落的144对物种进行了相互入侵试验，但没有发现单一的非传递性三物种组，这表明实验的物种之间存在强烈的等级竞争。非传递性理论和本文发现之间的差异可能是由于竞争物种之间潜在的生态相互作用导致的。在本文的群落中，利用单一外部供应的限制性营养物质和交叉取食似乎是决定群落结构的主要生态相互作用，而非传递性可能通过干扰竞争或通过改变物种在资源之间的竞争力出现。  图3. 在稳定共存的群落中，物种对之间普遍存在竞争等级关系 （A）使用图2所示的试验数据，根据在成对竞争中排除的其他菌株的数量，对12个群落中的所有菌株进行从上到下的排序。网络中的灰色节点代表每个单独的菌株。红色箭头从配对竞争中优势菌株指向弱势菌株。蓝线连接共存的菌株。（B）二项式分布，N=77，P=0.25，表示如果随机交换（A）中的共存和排除链接，则表现出传递性的预期对数。红色空心圆圈标记了通过试验确定的破坏可传递性三物种组的数量（在本文例子中，为零）  ● 通过配对实验验证了多物种群落中各物种的稳定共存是群落更复杂或新兴的属性，是物种与物种、物种与环境相互作用的结果，这些物种能否稳定共存与它们是否能成对共存并无直接关联。 ● 在两两配对竞争过程中，竞争排斥具有等级性和传递性，即低等级物种会处于竞争劣势，且物种之间的竞争排斥关系是可传递的。 编辑|姜庚博 审阅|阮哲璞 校稿|李丹宁 点 |
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