  青蒿素作为一线的明星抗疟药物，已挽救了数百万人生命，为全球疟疾防治作出巨大贡献。此外，青蒿素作为一种重要的天然药物资源，许多研究也在探索青蒿素衍生物作为治疗癌症的老药新用潜力。然而，大多数青蒿素衍生物抑制肿瘤细胞的效力仍然有限，而且它们的作用机制还不清楚。
近日，贵州医科大学何彬团队在该研究领域取得了新进展，为活性天然产物的老药新用研究提供了新思路和新策略，相关研究成果发表在药物化学权威期刊《药物化学杂志》（J. Med. Chem. DOI:10.1021/acs.jmedchem.3c00824）。青蒿素衍生的PROTAC促进青蒿素老药新用并揭示其治疗靶点—PCLAF 蛋白水解靶向嵌合体（PROteolysis-TArgeting Chimeras, PROTACs）已成为人类疾病靶向治疗的一种有前途的新兴策略。PROTAC是一种双功能分子，其工作原理是将E3泛素连接酶募集到特定的靶蛋白，利用泛素蛋白酶体降解系统（UPS）诱导靶蛋白发生泛素化和随后的蛋白降解（图1）。PROTAC依靠事件驱动、亚化学计量和催化的方式发挥作用，不仅在提高效力和特异性、降低耐药性以及靶向“不可成药”靶点等方面比传统的小分子抑制剂更具有优势；另一方面，PROTAC还可与蛋白质组学结合用于发现小分子抑制剂或活性天然产物的潜在靶标。由此可见，新兴的PROTAC技术已成为一种强大的工具，不仅可以提高化合物的效力，而且还可同时用于探索它们的治疗靶点。何彬团队采用PROTAC策略，选择青蒿琥酯、双氢青蒿素和青蒿素二聚体SM1044作为起始原料，通过接头与CRBN E3连接酶配体泊马度胺偶联。考虑到青蒿素的结构特点及其构效关系，通过对青蒿素的-OH位点、青蒿琥酯的-COOH位点和SM1044的-NH位点可以很容易地转化为四个新的青蒿素衍生物系列，分别是AR、AQ、AT和AD（图1）。
通过细胞活性评估发现，SM1044衍生物AD4对肿瘤细胞RS4;11、RPMI-8226、U266的抗肿瘤活性（IC50）分别为50.6±6.3、235.3±26.0和342.8±11.6 nM，且化合物AD4的抗RS4;11细胞增殖活性强于化合物SM1044抗RS4;11细胞增殖活性的12倍之多，并且化合物AD4可促进肿瘤细胞RS4;11发生细胞凋亡和G1期阻滞（图2）。通过动物实验评估发现，AD4以剂量依赖的方式延长了RS4;11小鼠的生存周期，同时没有观察到显著的体重减轻或不良反应（图3）。这些发现表明，化合物AD4具有血液瘤的治疗潜力。
为了研究化合物AD4治疗肿瘤的潜在靶点，何彬团队结合定量蛋白质组学方法，发现了所有下调的蛋白质（图4A）。聚类热图显示ALAS1、ZFAND5、ETS1、PCLAF、MEA1、DNAJC12、PET100和BETS等8个蛋白显著下调，而KEGG分析显示细胞周期和细胞衰老相关蛋白显著富集。通过AD4处理的RS4;11细胞裂解物的蛋白质印迹分析进行进一步筛选和验证，发现只有PCLAF的降解是显著的，并且它的降解可以通过与蛋白酶体抑制剂MG132共同孵育来缓解，这表明PCLAF可能是AD4的潜在靶标（图4B）。如图5所示，剂量爬坡实验进一步表明，化合物AD4诱导PCLAF降解的DC50值为54.92±9.55 nM，且AD4的最大降解率（Dmax）高达95±2%。时间进程实验表明，AD4对PCLAF的降解在4小时后出现，并在24小时后达到PCLAF的最大降解。PCLAF在AD4冲洗后的24小时可以完全恢复，说明这种降解是可逆的。此外，当化合物AD4与其母体化合物SM1044或泊马度胺（Poma, 即CRBN E3连接酶配体）共同处理，或单独与AD4的失活化合物AD5处理时，PCLAF的表达水平恢复，表明AD4与PCLAF和CRBN E3连接酶的结合对AD4诱导的PCLAF降解至关重要。
为了进一步证实PCLAF是AD4的直接靶标，使用细胞热位移分析（CETSA）、药物亲和反应的靶点稳定性（DARTS）分析和表面等离子体共振（SPR）分析来评估AD4与PCLAF结合的能力。结果显示，在CETSA测定中，AD4显著增加了PCLAF蛋白的细胞热稳定性；在DARTS测定中，经过AD4处理后，PCLAF的降解显著减少；通过SPR测定，SM1044和AD4的平衡解离常数（KD）值分别为183.3和6.1 mM，表明AD4对PCLAF具有更高的结合亲和力（图6）。AD4可以通过降解PCLAF来诱导p21的上调和Rb磷酸化的下调，最终下调抗凋亡蛋白Bcl-2和上调促凋亡蛋白Bax，从而促进细胞凋亡。最后，分子对接分析显示：化合物SM1044和AD4虽然都可以在其倍半萜内酯的骨架与PCLAF的残基Phe68和Trp61之间形成疏水性相互作用；然而，与SM1044的仲胺与PCLAF的残基Gln62形成的氢键相比，AD4的叔胺与PCLAF的残基Lys63形成的氢键更紧密，这也许可以解释化合物AD4对PCLAF的亲和力要高于SM1044。总之，这些结果证实AD4通过直接靶向PCLAF激活p21/Rb通路来发挥抗肿瘤作用的（图6）。
何彬团队充分利用了中药活性成分青蒿素的结构，采用PROTAC策略，巧妙地设计合成一系列新型青蒿素衍生物，获得了一个在细胞和小鼠模型中表现出显著抗肿瘤活性的衍生物AD4。结合蛋白质组学等方法，发现并证实了PCLAF是AD4的直接靶蛋白；AD4通过降解PCLAF来激活p21/Rb通路，从而发挥抗肿瘤活性。研究结果表明，青蒿素衍生物AD4作为靶向降解PCLAF的新型候选药物有望用于治疗多种血液瘤。
该研究成果于近日发表在药物化学权威期刊《药物化学杂志》（J. Med. Chem. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.3c00824）。本论文的通讯作者为贵州医科大学何彬教授和李燕副教授、上海中医药大学赵庆杰研究员。贵州医科大学李燕教授为论文第一作者，硕士研究生曾紫微和陈迪为共同第一作者。该项研究得到国家自然科学基金（81960628, 82160655 and U1812403-5）、贵州省科技厅项目（GCC [2022]030-1, CXTD [2022]005, ZK [2022]035 and [2020]1Y395）的资助。Facilitated Drug Repurposing with Artemisinin Derived PROTAC: Unveiling PCLAF as a Therapeutic TargetYan Li,*,§a Zi Wei Ze,§a Di Chen,§a Zhi Cheng Gu,a Wan Li Yan,a Ling Yun Yue,b Ren Guang Zhu,a Yong LongZhao,a Lei Chen,a Qing Jie Zhao,*c Bin He*a J. Med. Chem., 2023, DOI: 10.1021/acs.jmedchem.3c00824
何彬教授课题组致力于新型疾病治疗靶点的合理药物设计、活性天然产物的定向结构改造。何彬，贵州医科大学教授，博士生导师，国务院特殊津贴专家，贵州省省管专家，贵州省高层次创新型人才。贵州省靶向药物研究科技创新人才团队负责人，贵州省药物制剂重点实验室、教育部民族药与中药开发应用工程研究中心的学术带头人。主要研究方向为药物化学和化学生物学。已在Nature、Science和J. Am. Chem. Soc等期刊发表SCI论文50余篇，获授权中国发明专利8项，获授权美国发明专利1项。先后荣获贵州省首批“百千万人才引进计划”千人创新人才，教育部自然科学奖一等奖，第十四届贵州省青年科技奖，贵州省自然科学奖一等奖。
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