【原】发现肺纤维化发病的中心机制

2023年8月31日

理化研究所

神户大学

滨松医科大学

发现肺纤维化发病的中心机制-光治疗特发性肺纤维化-

-光治疗特发性肺纤维化-

理化学研究所(理研)生命功能科学研究中心呼吸系统形成研究小组成员榎本泰典研究员(当时) (现客座研究员，滨松医科大学再生感染病理学讲座助教)、森本充组长、神户大学医学院附属医院呼吸内科永野达也讲师等联合研究小组，对肺泡细胞有机物质[1] 利用一种叫做培养的新细胞培养技术，在培养皿上再现了迷你肺泡，成功地阐明了肺纤维化[2]发病的最早期现象。 本研究成果是肺纤维化的代表疾病，有望为缺乏有效治疗方法的难治性特发性肺纤维化( IPF ) [2]的病情阐明和新治疗药物的开发做出贡献。 特发性肺纤维化是肺泡壁增厚变硬(纤维化)，恶化时呼吸功能降低，是与生命相关的疾病。 此次，共同研究小组应用在试管内制造与实际脏器非常相似的三维组织的培养技术，成功地制作了人和老鼠的肺泡细胞有机物质，再现了肺的纤维化。 对纤维化的肺泡细胞有机物质的详细分析表明，ⅱ型肺泡上皮细胞[3]这种肺泡上皮中的组织干细胞[4]在肺纤维化的发病中起着中心作用，以其细胞老化为契机向纤维化诱导的特殊细胞状态变化。 研究表明，纤维化诱导的ⅱ型肺泡上皮细胞向周围分泌纤维化诱导物质TGFβ[5]，并且TGFβ对自身的作用呈正反馈[6]，诱导IPF特有的非炎症性纤维化。 本研究刊登在在线科学杂志《Nature Communications》( 8月31日:日本时间8月31日)上。

应用肺泡有机物质模型阐明肺纤维化诱导流程

背景

承担肺气体交换功能的肺泡，由覆盖在表面的肺泡上皮细胞和填埋在组织间的肺纤维母细胞[7]等构成。 肺纤维化是一种由于某些原因导致肺成纤维细胞分化为肌成纤维细胞[7]，胶原等异常蛋白质堆积，导致肺泡壁增厚变硬(纤维化)的疾病(图1 )。 如果这种病情发展，呼吸功能就会下降，关系到生命。 特发性肺纤维化( IPF )是肺纤维化的代表性疾病，由于原因不明、治疗困难，生命预后差，在日本也被指定为疑难病症。

图1肺泡和肺纤维化

示意图显示了构成肺泡的细胞中，2种肺泡上皮细胞(ⅰ型和ⅱ型)和肺成纤维细胞。 肺纤维化是由肺成纤维细胞分化成肌成纤维细胞引起的。

肺泡的上皮细胞分为ⅰ型和ⅱ型两种类型，ⅱ型肺泡上皮细胞也作为组织干细胞发挥作用。 肺泡受伤后，ⅱ型肺泡上皮细胞增殖补充自身，进而分化成ⅰ型肺泡上皮细胞[3]，肺泡得以再生。 根据最近的研究，IPF的发病与ⅱ型肺泡上皮细胞的障碍和从肺成纤维细胞分化出的肌成纤维细胞的增殖有关。 但是到目前为止，将ⅱ型肺泡上皮细胞的障碍和肌成纤维细胞的分化直接联系起来的知识还不充分。 另外，一般来说，众所周知各种内脏器官的纤维化的诱导与炎症有关，但IPF的肺部缺乏炎症表现，我们知道实际上对IPF患者进行抑制炎症的治疗也无效。 也就是说，这提示了存在不依赖于炎症的纤维化过程。 因此，联合研究小组从小鼠和人肺的活组织中只取出ⅱ型肺泡上皮细胞，在试管内培养，重构肺泡组织，挑战了不依赖于IPF特有炎症的纤维化过程的阐明。

研究方法和成果

联合研究小组最初调查了肺部的纤维化是如何发展的。 向小鼠气管内给予博莱霉素诱导肺纤维化的药剂，诱导肺纤维化，进行机体肺纤维化发病过程随时间推移的评估，结果确认1 )发生ⅱ型肺泡上皮细胞的DNA损伤，2 )炎症，3 )肌成纤维细胞的诱导，4 )纤维化 接下来，为了验证在不产生炎症的环境中是否也会诱导纤维化，我们进行了将引起炎症的免疫细胞除外的肺组织从生物体中分离出来，在试管内使博莱霉素发生作用的实验。 这时也能看到肌成纤维细胞的诱导，显示纤维化过程中炎症可能不是必须的。 因此，为了在细胞水平·分子水平上更加详细地评价肺纤维化，决定用流式细胞术[8]的方法只取出小鼠的ⅱ型肺泡上皮细胞，将其进行三维培养，制作肺泡细胞有机物质，调查与肺成纤维细胞的相互作用(图2 )。

图2肺泡有机物质的制备

用流式细胞术从小鼠肺中取出ⅱ型肺泡上皮细胞，进行三维培养，形成右边所示球体肺泡细胞有机物质(直径约2mm )。

为了再现肺纤维化，在肺泡有机物质培养的培养基中添加博莱霉素造成DNA损伤，然后在同一个培养皿中培养小鼠肺成纤维细胞。 在该小鼠肺成纤维细胞中，预先嵌入了分化成肌成纤维细胞时发出红色荧光的报告基因[9]。 通过该实验系统，成功实时成像了上皮受损的有机物质周围的肺成纤维细胞被肌成纤维细胞诱导的情况(图3 )。

图3上皮损害诱导纤维化的实时成像

博莱霉素作用于肺泡细胞有机物质诱导DNA损伤，然后共同培养肺成纤维细胞，对向肌成纤维细胞的分化进行实时成像。 通过整合了红色荧光蛋白质的报告基因的表达来监测向肌成纤维细胞的分化。

其次，为了明确受到DNA损伤的ⅱ型肺泡上皮细胞获得纤维化诱导能的过程，全面分析了肺泡细胞有机物质中表达的基因。 结果表明，因投用博莱霉素而受到DNA损伤的有机物质中，细胞老化的代表性信号p53信号[10]正在提高。 因此，用提高p53信号的药剂处理肺泡有机物质时，观察到即使不投用博莱霉素，周围的肺成纤维细胞也会被肌纤维细胞诱导。 这提示，接受p53信号分泌的因子与纤维化的诱导相关。 更详细地调查了p53信号和肺泡有机物质的关系，结果在ⅱ型肺泡上皮细胞中p53信号升高时，变化为被称为" AT2-AT1迁移样状态"的、相当于细胞分化的中间状态，与暂时表达细胞衰老特征性基因的细胞非常相似的细胞状态 进入这个细胞状态后，通过统称为sasp ( senescence-associated secretory phenotype :细胞老化相关分泌现象)的现象，老化细胞会分泌出特征性的蛋白质。 因此，从SASP的蛋白质组中探索了诱导肌成纤维细胞的因子，发现TGFβ符合要求。 ⅱ型肺泡上皮细胞向周围分泌的TGFβ，作为自动[11]作用于ⅱ型肺泡上皮细胞自身，放大TGFβ的表达和活性，发生了所谓的正反馈现象(图4 )。 另外，由于TGFβ的活化足以使ⅱ型肺泡上皮细胞变化为“AT2-AT1迁移样状态”，因此我们得出结论，ⅱ型肺泡上皮细胞中TGFβ的正反馈才是不依赖于炎症的肺纤维化的中心机制。

图4以ⅱ型肺泡上皮细胞为起点，与炎症无关的肺纤维化诱导过程机制

在受到DNA损伤的ⅱ型肺泡上皮细胞中，p53信号升高，发生细胞老化。 由此，ⅱ型肺泡上皮细胞变为纤维化诱导的状态，分泌TGFβ。 TGFβ在诱导周围肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的同时，还作用于分泌源ⅱ型肺泡上皮细胞自身，进而提高其纤维化诱导能力。

最后，为了验证这些现象在人的肺中是否也能看到，从接受了切除手术的人肺组织中取出ⅱ型肺泡上皮细胞，用有机物质进行了同样的实验。 结果，即使使用人的肺细胞，也存在TGFβ的正反馈，确认了不依赖于炎症的肌成纤维细胞的诱导。

今后的期待

到2023年为止，被IPF认可的治疗药剂只有2种，很遗憾，其效果也仅限于抑制疾病的发展。 这些药物以肺成纤维细胞和肌成纤维细胞为主要治疗靶点，但联合研究组通过肺纤维化有机物质模型再次验证，仍未能抑制肌成纤维细胞的诱导。 此次研究表明，ⅱ型肺泡上皮细胞TGFβ正反馈的成立是肺纤维化的核心机制。 这表明了上皮在IPF病情形成中的重要性和对此的治疗可能性，期待对IPF的新治疗药物的探索做出贡献。

补充说明

• 1 .肺泡有机物质 三维培养肺泡上皮细胞制作的伪肺泡组织。 有机物质技术近年来在各种器官组织的研究中得到了应用。 2 .肺纤维化，特发性肺纤维化( IPF ) 肺纤维化是由于胶原蛋白等纤维状蛋白质在肺泡间质中异常堆积，妨碍肺泡气体交换功能的疾病的总称。 特发性肺纤维化是原因不明、肺部发生纤维化的代表性疾病。 症状可持续数月至数年，以劳作时呼吸困难、咳嗽及进行性肺功能减退为特征。 IPF是idiopathic pulmonary fibrosis的缩写。 3.Ⅱ型肺泡上皮细胞，ⅰ型肺泡上皮细胞 肺外周存在的肺泡由ⅰ型和ⅱ型两种上皮细胞构成。 ⅱ型肺泡上皮细胞是肺泡上皮的组织干细胞，具有产生分化细胞ⅰ型肺泡上皮细胞的能力。 ⅰ型肺泡上皮细胞非常薄，为肺泡内空气中的氧与位于ⅰ型肺泡上皮背面的血管内的二氧化碳交换提供了平台。 4 .组织干细胞 指身体各种组织中原本存在的未分化细胞(具有分化为各种细胞能力的细胞)。 为组织的维持和再生做出贡献。 5.TGFβ 分泌到细胞外，在组织发生、细胞分化、胚胎发生等中起重要作用的增殖因子。 TGF是传输图形因子的缩写。 6 .正面反馈 某个基因或蛋白质的表达量增大时，受其结果影响表达量进一步增大的状态。 7 .肺成纤维细胞、肌成纤维细胞 成纤维细胞是结缔组织的主要细胞，具有大量分泌胶原等细胞外基质和生长因子等功能。 肺成纤维细胞病态时变为肌成纤维细胞，表达平滑肌组织中可见平滑肌肌动蛋白，细胞变大变硬，大量表达胶原蛋白。 8 .流式细胞术 利用荧光激光分析和分选不均匀混合液中细胞的技术。 9 .报告子基因 监测细胞特征状态的外源基因。 使用基因工程技术导入编码荧光蛋白质的报告基因，可以使用细胞发出的荧光进行检测。 10.p53信号 p53被鉴定为抑癌基因制造的蛋白质。 实际上是除了抑癌功能以外，还起着细胞分化、细胞增殖、细胞死亡的控制、细胞老化等多种作用的核内蛋白质，受细胞受到的压力等刺激，控制着各种基因的表达。 在此，将以P5-3为中心的细胞应答途径表示为P5-3信号。 11 .自动扶梯 细胞分泌的因子作用于分泌的细胞自身。

联合研究组

理化研究所生命功能科学研究中心呼吸道形成研究小组 研究员(研究当时)榎本泰典 (现客座研究员，滨松医科大学再生感染病理学讲座助教) 团队领导森本充 研究员桂广亮 客座研究员藤村崇 (大冢制药株式会社大阪创药研究中心创药模态研究所研究员) 神户大学医学部附属医院 呼吸内科 讲师永野达也 助教羽间大祐 呼吸外科 教授/医院院长真庭谦昌 医院副教授田中雄悟

研究支援

本研究由日本学术振兴会( JSPS )科学研究经费资助事业青年研究“采用有机物质技术，探索以肺泡上皮细胞老化为目标的肺纤维化新药(研究代表者:榎本泰典)”，该研究具有挑战性(萌芽)“探讨肺纤维化引起的损伤-再生-炎症-纤维化过程 根据冈本敏纪念肺纤维化研究基金资助(研究代表:榎本泰典)、G-7奖学金基金会资助(研究代表:森本充)、理研生命功能科学研究中心( BDR )有机物质项目(研究代表:森本充)资助进行。

原论文信息

• Yasunori Enomoto, Hiroaki Katsura, Takashi Fujimura, Akira Ogata, Saori Baba, Akira Yamaoka, Miho Kihara, Takaya Abe, Osamu Nishimura, Mitsutaka Kadota, Daisuke Hazama, Yugo Tanaka, Yoshimasa Maniwa, Tatsuya Nagano, Mitsuru Morimoto, "Autocrine TGF-β-positive feedback in profibrotic AT2-lineage cells plays a crucial role in non-inflammatory lung fibrogenesis", Nature Communications, 10.1038/s41467-023-40617-y

主讲人

理化研究所 生命功能科学研究中心呼吸道形成研究小组 研究员(研究当时)榎本泰典 (现客座研究员，滨松医科大学再生感染病理学讲座助教) 团队领导森本充 神户大学医学部附属医院呼吸内科 讲师永野达也

榎本 泰典

森本 充

永野 達也

新闻发言人

理化研究所宣传室新闻发言人 神户大学总务部宣传科 tel:[phone] /传真: [phone] email:PPR-kouhoushitsu [ at ] office.Kobe-u.AC.jp 滨松医科大学总务科宣传室 tel:[phone] /传真: [phone] Email: koho [at] hama-med.ac.jp ※请将上述[at]替换为@。