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1.MIMA组件和设计MIMA系统中用于药物输送的IMD是一个5毫米长、0.75毫米直径的生物相容性树脂圆柱体，可以在活体组织内的18个空间分离区域内输送多种药物或药物组合。IMD装载有用聚乙二醇（PEG）制备的半固态药物，以便在被动扩散的情况下通过植入释放出具有可控动力学的药物 24 。IMD中药物的局部浓度被调整到在组织中的每个位置产生与全身治疗期间相似的药物水平。 经过3天的治疗，肿瘤在IMD的位置上被收集，并制备成福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）样本，然后沿着IMD轴线正交切割成连续的组织切片。通过mIHC（一种连续免疫染色、成像和剥离的过程）对每个药物输送孔进行染色，以评估局部药物效应，使用一系列具有特定染色模式的标记物进行交叉验证，这些标记物是使用循环免疫荧光（cycIF）生成的。通过分割单个细胞并计算每个分割细胞中的蛋白表达水平，分析mIHC生成的多蛋白图像。作者为这些研究开发了一个包括30多种蛋白质的全面的针对小鼠的读数面板，以探究广泛的肿瘤和TME状态和功能，并识别具有优先检测早期和局部反应的可操作表型。
2.MIMA识别出与药物相关的组织学特征，预测肿瘤微环境反应，并预测合理的治疗组合作者使用MIMA系统进行了小规模原位筛选，并定量评估了对七种美国食品药品监督管理局（FDA）批准的具有不同作用方式的药物的反应。目标药物包括聚（腺苷二磷酸（ADP））核糖聚合酶（PARP）抑制剂奥拉帕尼布、多激酶血管内皮生长因子受体（VEGFR）-1/2/3抑制剂雷伐替尼、细胞周期依赖性激酶（CDK）-4/6抑制剂帕博西尼、B细胞淋巴瘤（BCL）-2抑制剂维奈替克拉和泛组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂帕诺比尼斯塔。化疗药物包括DNA插入剂多柔比星和有丝分裂抑制剂紫杉醇，这些药物通常用于乳腺癌的一线治疗。作者的MIMA分析集中在细胞和分子组成以及在靠近药物输送部位的区域与同一肿瘤中远离肿瘤内部的对照组相比显著富集的组织结构。 3.Palbociclib引发CSF1R富集的巨噬细胞与血管外膜细胞分支和新生肿瘤增殖相关在肿瘤内部使用帕博西尼布治疗导致了多种基质细胞在检测区域的显著积聚，包括CSF1R、MHC-II、促肿瘤的巨噬细胞、内皮细胞、外膜细胞和间充质细胞。空间分析测量细胞在距离药物输送孔越来越远的位置的相对丰度，显示CD45巨噬细胞（按照标准细胞类型分类）定位于紧邻药物输送孔的区域，而CD45较不成熟的巨噬细胞则定位于近端和远端的区域，在某些区域与收缩的外膜细胞相关。 作者还通过绘制特定表型的十个或更多细胞在直径为30μm、50μm或75μm的区域内聚集的位置来评估特定细胞类型的聚集倾向。作者在EMT6乳腺癌模型的系统性治疗中测试了这种MIMA预测的性能，通过给免疫能力完整的同种异基因小鼠乳腺脂肪垫内植入肿瘤的小鼠进行腹腔注射帕博西尼布、抗CSF1R抗体单药治疗以及两者的联合治疗。单个药物对肿瘤生长速率没有影响。 4.Venetoclax招募表型不同的DC群集、未成熟髓系细胞和内皮细胞使用Venetoclax进行肿瘤内治疗导致CD11c DCs、未成熟髓样细胞和CD31内皮细胞显著聚集到药物测定区域。与palbociclib条件不同，CD31内皮细胞不表达αSMA，这表明它们形成的小血管没有被外周细胞支持。在Venetoclax输送附近的区域，CD11c DCs被聚集成多个空间分离的簇，而在远离药物释放点的随机肿瘤内区域中则没有。这些簇在形态学和Epcam、CD45、MHC-II和CD11b的表达上与储备区域的距离有所不同。靠近储备区域的DCs显示出更亮更小的细胞核，超过60%的细胞为Epcam CD45，表明它们具有吞噬能力；而其他细胞显示出典型的未刺激的髓系细胞“靶心”膜CD45染色模式。 作者对E0771原位乳腺癌模型进行了系统性治疗的假设测试，使用了Venetoclax和一种抗CD40激动剂的组合。结果显示，这种组合减缓了肿瘤生长速度，并且整体存活率提高，超过60%的小鼠存活时间超过12个月。相比之下，Venetoclax与程序性死亡配体-1（PD-1）抑制抗体的组合对肿瘤生长速度或存活率没有显著影响。再次证明，MIMA预测的治疗策略在整体动物实验中是有效的。
5.Panobinostat引发免疫原性细胞死亡，与抗原呈递中性粒细胞和巨噬细胞的招募有关泛泛诺斯他在肿瘤内部的输送导致了多种免疫细胞群体的显著招募，包括树突状细胞、抗原呈递巨噬细胞和（抗原呈递）中性粒细胞，其中后者最为丰富。中性粒细胞被认为是对病原体的快速应答者，并且与树突状细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞相比，经典上不被归类为专业的抗原呈递细胞（APCs），后者具有更强的激活初级T细胞的能力。然而，13%的中性粒细胞表达MHC-II，表明它们经历了强烈的表型成熟。最近，已经将MHC-II中性粒细胞与免疫原性细胞死亡（ICD）联系起来，在ICD过程中，它们吞噬垂死的肿瘤细胞并对残留细胞进行呼吸爆发依赖的细胞毒作用。然而，这些治疗并未实现长期的肿瘤控制，在疫苗接种研究中，只有EMT6和E0771模型中的一部分小鼠在再次挑战后拒绝了肿瘤。这些结果表明，可能存在抵抗泛波诺斯单抗介导的抗肿瘤免疫的抵抗机制，因此作者对这种治疗条件进行了更详细的探索。
6.乳腺癌早期诱导的抗肿瘤免疫反应的应答生物标志物和耐药机制通过文献综述，作者生成了一个早期原位生物标志物的列表，这些标志物与ICD、增加肿瘤CD8 T细胞浸润和/或ICB疗效直接或间接相关。这些标志物包括细胞间粘附分子1（ICAM1）、髓过氧化物酶（MPO）、钙调蛋白、MHC-I、半乳糖凝集素-3、神经丛粘附分子-1和PD-L1。作者验证了这些生物标志物在泛波尼诺斯塔储库中的存在，并测量了它们与标准基质细胞类型在实验区域的表达和空间关联，以及CSCs（Epcam CD45 PyMT Ki67 Sox9）肿瘤细胞的一个子集，具有自我更新和肿瘤起始能力，通常对抗癌治疗表现出抵抗性。 7.泛波尼斯他、维尼托克拉和抗CD40免疫疗法的联合应用最大程度地增强了对乳腺癌的肿瘤杀伤和抗肿瘤免疫力观察到的CSCs和DCs之间的空间关联以及对泛波尼斯塔和维尼托克拉克的观察到的反应，使作者想到了一种策略，通过免疫调节来最大化抗肿瘤活性。在这种策略中，泛波尼斯塔诱导肿瘤大块的免疫原性细胞死亡，而CSCs在肿瘤微环境中保持耐药性。维尼托克拉克诱导DCs的招募，作者已经证明它们定位于现在可以接触到的CSCs区域。作者假设捕获并处理了邻近CSCs的抗原的DCs经CD40连接后会激活CSC特异性的抗肿瘤免疫，从而导致完全的肿瘤清除。 因此，泛波尼斯塔被假设在肿瘤大块的水平上诱导抗肿瘤免疫，而维尼托克拉克/抗CD40在耐药的肿瘤起始CSCs的水平上诱导抗肿瘤免疫。作者注意到，在抗CD40单药治疗组中，有两只小鼠死亡。抗CD40作为单一药物的致命毒性曾被报道，原因是由于一种类似休克的综合征，作者的数据也表明，只有在先前给予抗癌药物的情况下，这种免疫疗法才能被耐受。虽然抗原特异性T细胞反应仍需进行关键评估，但总体而言，这些结果表明，低剂量泛泛斑点素、维内替克和抗CD40的三联组合是一种高度协同的长期乳腺癌控制治疗策略。
至此，这篇文章就介绍完啦，总结一下：作者首先详细地探讨了使用一个可植入的微型设备在肿瘤的不同部位以纳剂量给药的技术；第二部分描述了如何通过多重成像对肿瘤微环境状态进行研究，以及肿瘤细胞和免疫反应对不同治疗方案的响应；第三部分深入分析了在乳腺癌的小鼠模型中鉴定出的有效药物组合；第四部分叙述了其中最有效的三重疗法在各种模型中诱导肿瘤的完全缓解及其未来的治疗前景。全文内容详实，为作者揭示了肿瘤治疗中药物组合的重要性，为肿瘤生物学和生信分析提供了新的研究方向，对于研究肿瘤的朋友们来说是一篇不容错过的好文章！ |
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