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摘 要 大剂量维生素C（HVC）治疗是一种相对安全和廉价的肿瘤治疗方法，能够通过促氧化应激、表观遗传修饰、抑制缺氧诱导因子（HIF-α）和免疫调控等途径产生抗肿瘤作用，然而，HVC单独应用仅对肿瘤有较弱的抑制作用，同时，治疗效果与肿瘤代谢表型有密切关系。HVC对KRS/BRAF、HIF、TETs/IDH/WT1突变和OMMCyb5R3/VDAC1复合体、维生素C转运体高表达的肿瘤治疗敏感，而对KRS/BRAF低表达的肿瘤无明显抑制效应，说明HVC需要针对肿瘤代谢表型进行精准治疗。大剂量维生素组合、维生素C纳米化、溶瘤病毒、程序性死亡受体1（PD-1）/程序性死亡配体1（PD-L1）单克隆抗体等免疫检查点抑制剂、放射治疗、细胞毒性药物治疗、中医中药等可明显提高HVC治疗肿瘤效果，提示精准强化治疗是HVC治疗重要研究方向，但需要更多的临床试验证据支撑。 关键词：大剂量维生素C；肿瘤；精准治疗；强化治疗 正 文 自从1976年Cameron E和Pauling L[1]报道大剂量维生素C（high-dose vitamin C，HVC）治疗延长肿瘤患者生存期以来，关于肿瘤HVC治疗的争论不断。虽然1985年梅奥医学中心Moertel CG等[2]发文否认了肿瘤HVC的治疗效果，但多数临床前试验等证据仍显示HVC能通过促氧化应激、表观遗传调控等多种机制产生抗肿瘤作用[3-4]。由于恶性肿瘤患者常合并营养不良的状态[5]，HVC治疗是一种相对安全、有效的治疗方法[6]。随着维生素C药物动力学和抗瘤机制研究的进展，HVC治疗肿瘤临床方案越来越规范了。但HVC单独治疗肿瘤疗效甚微，对于一些特殊代谢表型肿瘤，或者联合其他方法能获得更好疗效，HVC需要精准强化治疗肿瘤[7-8]。 1 大剂量维生素C治疗临床优势方案 HVC治疗肿瘤效果依赖于细胞内维生素C浓度和滞留时间。生理剂量维生素C血浆浓度为26~84μmol/L，发挥抗氧化作用；100μmol/L~0.5mmol/L维生素C调控表观遗传失调；而超过0.5mmol/L主要通过促氧化反应抑制肿瘤[9-10]。口服200mg后血浆浓度可达到80μmol/L，口服剂量超过200mg时，吸收率下降、尿排泄增加，维生素C血药浓度仍无法达到毫摩尔级，只有通过静脉注射才能达到促氧化血药浓度[11]。如在剂量达到75g时表现出一级药物动力学特征，在100g时血浆最大浓度趋于稳定[12]。由于维生素C半衰期仅为2h，较为科学的静脉给药方案是75g，2次/d[13]。 芬顿反应是维生素C促氧化应激反应模式。维生素C参与芬顿反应的作用是提供电子，在细胞外Fe3+氧化为Fe2+，同时产生H2O2、O-2和抗坏血酸自由基（ascorbate free radical，AFR）；在细胞内，1mol H2O2与1mol的芬顿反应后生成1molFe3+，同时生成1mol的OH-外加1mol羟自由基，诱发脂质过氧化导致细胞死亡[14]。芬顿反应强度还依赖于细胞内Fe2+池含量，血清铁蛋白或游离铁低水平可影响HVC疗效，可在使用前2~3d前适量补充铁剂。维生素C刺激还原型谷胱甘肽氧化成二聚体氧化形式导致过氧化氢积累，促进细胞凋亡。 经静脉注射HVC治疗后继续口服10g/d的维生素C可预防突然停药后发生的急性维生素C缺乏症，口服维生素C使患者维生素C血浆浓度能达到100μmol/L~0.5mmol/L发挥表观遗传调控作用进而加强维生素C的抗肿瘤作用。然而，即使口服1.25g/kg剂量，维生素C血浆浓度也仅能达到200μmol/L[15]，按照剂量设计能否达到治疗目标需进一步研究。 2 大剂量维生素C精准治疗肿瘤 HVC治疗肿瘤效果与特定的肿瘤表型有关，绘制HVC治疗敏感性代谢和分子图谱有利于实现肿瘤HVC精准治疗。初步证实HVC治疗肿瘤敏感相关代谢分子表型有维生素C转运体、OMM Cyb5R3/VDAC1复合体、KRS和BRAF突变、TET2/IDH1/WT1突变和HIF突变。 2.1 维生素C转运体 维生素C以还原型抗坏血酸和氧化型脱氢抗坏血酸（dehydroascorbic acid，DHA）两种形式存在。抗坏血酸通过钠依赖性维生素C转运蛋白（sodium-dependent vitamin C transporter，SVCT）1主动转运被吸收，并通过SVCT2进入细胞；DHA主要通过葡萄糖转运体（glucose transporter protein，GLUT）中的GLUT1、GLUT3转运入细胞。SVCT2高表达的细胞，干细胞相关基因Sox-2、Oct-4、Lin28或肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）标志物CD133也呈现出高表达的状态，使肿瘤对HVC更加敏感[16]。不同组织类型肿瘤维生素C转运体存在很大差异，SVCT基因单核苷酸多态性影响维生素C血浆浓度和细胞内含量，分析肿瘤细胞转运体有助于预测HVC疗效。 2.2 OMM Cyb5R3/VDAC1复合体 OMM Cyb5R3/VDAC1氧化还原复合体是表达在线粒体外膜，能利用胞质NADH作为电子供体催化抗AFR快速转化为抗坏血酸盐，恢复抗坏血酸“池”，维持细胞内NAD+/NADH比例和ATP产生而保护线粒体免受氧化损伤[17]。正常细胞活性氧家族（reactive oxygen species，ROS）低水平和还原物正常水平，OMM Cyb5R3/VDAC1确保线粒体呼吸和ATP正常产生；肿瘤细胞ROS过度产生、缺氧环境和细胞溶质NADH升高，OMM Cyb5R3/VDAC1代偿性过表达也保护肿瘤细胞，这是OMM Cyb5R3/VDAC1的“保护模式”。HVC治疗时，AFR在肿瘤细胞永久性累积，OMM Cyb5R3/VDAC1反馈性受抑伴线粒体膜间隙AFR和细胞质NAD+/NADH降低，引起呼吸链电子流、质子流障碍，辅酶Q（coenzyme Q，CoQ）“池”失衡并启动反向电子传输导致细胞死亡，此为OMM Cyb5R3/VDAC1的“破坏模式”，OMM Cyb5R3可作为HVC治疗肿瘤的有效性标志物[18]。 2.3 KRS/BRAF突变 KRS/BRAF突变激活下游MAPK通路，导致GLUT1表达上调，提高细胞摄取DHA的能力和速率[19]。KRS/BRAF突变肿瘤细胞严重依赖糖酵解生存和生长，抑制糖酵解可能会耗尽ATP，引发能量危机而致细胞死亡，KRS/BRAF突变肿瘤对HVC尤为敏感。一项442例肠癌患者临床试验表明，HVC治疗与对照组相比，无进展生存（progress-free survival，PFS）期、有效率和总生存期无差异，但KRS基因突变患者接受化疗联合HVC治疗的PFS期长于单纯化疗（9.2个月比7.8个月）[13]。 2.4 TETs/IDH/WT1突变 维生素C作为脱甲基酶（demethylases，TETs）辅助因子，能直接与TETs酶C端催化结构域作用，将Fe3+还原为Fe2+并激活TETs参与DNA去甲基化而抑制肿瘤[20]。TETs包括TET1、TET2和TET3，在肿瘤中的表达具有显著个体化差异，尤其TET2在髓系和淋巴系肿瘤中突变率高。然而，TET2突变与异柠檬酸脱氢酶1/2（isocitrate dehydrogenase 1/2，IDH1/2）或WT1基因（Wilms tumor gene 1，WT1）突变相互排斥[21]。IDH1/2催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸，是维持TETs等双加氧酶活性所必需的，其突变会导致代谢产物2-HG过量产生，后者竞争性抑制TET2功能；WT1是一种调节WNT和MAPK等信号通路、参与细胞分化和肿瘤抑制的转录因子，与TET2相互作用可促进肿瘤去甲基化，WT1突变阻碍WT1与TET2结合并激活WT1靶基因转录，导致TET2低活性和5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）低水平，后者被认为是肿瘤不良预后的独立标志物和TET调控异常标志[22]。HVC能减少DNA甲基化并通过提高TET2活性恢复5hmC DNA水平，进而抑制与肿瘤进展相关的表观遗传失调。在IDH1突变肿瘤细胞，每天给予维生素C（100μg/ml）可克服IDH1突变的影响，刺激TET2促进DNA去甲基化和转录因子结合位点的表观遗传重塑，从而诱导肿瘤细胞分化，与IHD1抑制剂有协同挽救TET活性作用[23]。TETs/IDH/WT1突变或5hmC低水平肿瘤对HVC治疗敏感，可作为肿瘤HVC治疗的有效复合标志物。 2.5 缺氧诱导因子表达 维生素C是低氧诱导因子（hypoxia-inducible factors，HIF）羟化酶辅助因子，诱导希佩尔-林道病（von Hippel-Lindau disease，VHL）肿瘤抑制蛋白识别HIF-1α，随后被泛素化和蛋白酶体降解。缺氧条件下，HIF-1α在特定脯氨酸和天冬酰胺残基上发生羟化作用，抑制蛋白酶体降解而转运至细胞核，与HIF-1β聚合并激活调控多种细胞功能的靶基因，如增殖、凋亡、血管生成和葡萄糖转运等。HIF-1α活性高可抑制TET2表达，HVC治疗HIF-1α高表达肿瘤会增加HIF羟化酶活性，从而降解HIF-1α，抑制该转录因子促瘤作用[24]。然而，在VHL基因突变的透明细胞肾癌患者，HIF-α的羟化降解会导致转录因子的积累，HIF-α活性与抗坏血酸含量没有关联关系，HVC不能对VHL基因缺陷的肿瘤有效[25]。相反，VHL基因正常的肿瘤患者由于缺氧条件导致HIF-α活性增加，HVC通过刺激HIF羟化酶活性增强HIF-α降解而获得更好疗效。 3 肿瘤大剂量维生素C强化治疗 3.1 大剂量维生素C联合放化疗 HVC和放射治疗（简称放疗）均是能利用正常细胞和肿瘤细胞的氧化还原状态差异，选择性地促进肿瘤细胞氧化应激超负荷，产生大量ROS和导致线粒体功能障碍，两者协同抗肿瘤机制与HVC和放疗均可以增加肿瘤细胞不稳定铁池水平，两者均能抑制肿瘤细胞RelB表达，放疗可促进H2O2生成而强化ROS介导的细胞毒性等有关。目前HVC联合放疗在临床试验中作为标准治疗方案能使患者在放疗期间症状总体强度评分降低近50%[26]；HVC联合放疗和吉西他滨治疗胰腺癌无进展生存（progress-free survival，PFS）期和总生存期均延长了（13.7个月比4.6个月、21.7个月比11.1个月）[27]。 在已经完成的23个HVC联合化疗药物治疗临床试验中，化疗药物主要是三氧化二砷、吉西他滨、卡铂和紫杉醇、替莫唑胺以及标准化疗方案FOLFOX。Welsh JL等[28]研究9例晚期胰腺癌受试者每周2次静脉注射维生素C，输注后血浆水平≥20mmol/L，同时接受吉西他滨治疗，完成至少2个周期（8周）治疗的受试者的PFS期为6.5个月、平均生存期13个月，历史对照为3.7个月、6.7个月。Furqan M等[29]完成一项HVC联合卡铂-紫杉醇治疗晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）临床试验，75g维生素C静脉注射，每周2次，卡铂和紫杉醇每3周1次，共4个周期，38例患者客观缓解率34.2%，疾病控制率84.2%，PFS和总生存期分别为5.7个月和12.8个月。 3.2 大剂量维生素C联合靶向治疗 与HVC联合的靶向药有抗血管药物、激酶抑制剂（如吉非替尼）、线粒体抑制剂（如二甲双胍）、PARP抑制剂、糖酵解抑制剂和丛生蛋白（clusterin，CLU）抑制剂等。Mustafi S等[30]采用100μmol/L的维生素C联合CLU抑制剂治疗黑色素瘤获得较好效果，其协同机制是表观遗传调控而非促氧化应激。西妥昔单抗诱导肿瘤细胞从糖酵解到氧化磷酸化的转换很容易受到HVC诱导的氧化应激的影响，相对大剂量维生素C（0.5g/kg）可消除西妥昔单抗耐药性，SVCT2可作为两者联合治疗KRAS突变结直肠癌（colorectal cancer，CRC）患者的潜在标志物[31]。聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制剂能抑制BRCA突变细胞DNA修复，联合维生素C可诱导DNA单链断裂，并通过实施第10-11碳转位（ten-eleven translocation，TET）蛋白介导的机制激活碱基切除修复（base-excision repair，BER）通路，产生双重DNA损伤效应[32]。靶向线粒体代谢药物黄连素联合相对低浓度维生素C（250μmol/L）能抑制90%以上肿瘤干细胞生长[33]。 3.3 维生素C纳米治疗 IVC治疗肿瘤疗效依赖于维生素C区室化血药浓度和持续时间。维生素C稳定性差、半衰期只有2h，且易受质膜SVCT2转运蛋白数量和代谢活性、给药途径、细胞质pH值和膜电位等因素影响。纳米化能屏蔽外部环境对维生素C的降解，增加其稳定性，实现可控释放，延长其瘤内滞留时间。有研究采用“维生素C-三聚磷酸钠-醇溶蛋白”配方设计一款纳米胶囊，缓释时间超过14d，保存10d后仅氧化5%[34]。Amiri S等[35]制备维生素C脂质体，20d后仍然获得稳定的维生素C释放。临床前研究表明，摄入维生素C纳米药物区室有效血药浓度和持续时间比游离维生素C提高约10倍，低浓度维生素C纳米胶囊口服也能达到促氧化作用。 3.4 大剂量维生素组合治疗 大剂量维生素组合有维生素C与维生素K3（M/A）、维生素C与维生素A组合（A/A）和维生素C与维生素B族（A/B）组合。维生素K3中的氧化醌发生单电子还原或双电子还原反应生成超氧自由基和消耗NADH、谷胱甘肽等还原性物质，还能选择性激活肿瘤细胞碱性脱氧核糖核酸酶而加剧HVC介导的DNA损伤。M/A对肿瘤细胞的毒性伴随着剂量依赖性线粒体超氧化物增加和ATP合成减少，从2~3倍（2/200μmol/L）到8~15倍（20/2000μmol/L），5/500μmol/L浓度是M/A对肿瘤细胞抑制作用向致死作用转变临界阈值[36]。M/A组合对肿瘤细胞毒性还与戊烯基转移酶结构域含蛋白1（UbiA prenyltransferase domain-containing protein1，UBIAD1）催化维生素K3转化为K2有关，UBIAD1在正常细胞高表达而肿瘤细胞低表达，UBIAD1的低表达会使维生素K3向K2转化会受到抑制，而维生素K2对肿瘤细胞的细胞毒性降低了两个数量级，UBIAD1表达是M/A治疗肿瘤代谢表型之一[37]。M/A组合剂量比为1∶100，该组合治疗17例局部标准治疗失败后前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen，PSA）连续2次上升患者，每天50g维生素C和50mg维生素K3，12周治疗后13例PSA降低，15例在12周后继续治疗患者只有1例在治疗14个月后死亡[36]。 M/A在5/500μmol/L范围内对正常细胞无毒性作用，但高浓度会降低正常细胞活力，亚凋亡剂量M/A组合联合维生素E类似物α-生育酚琥珀酸酯（alpha-tocopheryl succinate，α-TOS）治疗具有增效减毒作用。3.2mmol/L以下维生素C或其M/A组合对肿瘤细胞无抑制作用，但加入α-TOS却引起细胞死亡，这归功于α-TOS靶向线粒体呼吸链产生超氧阴离子自由基、溶酶体扰动和线粒体自分裂、细胞色素c胞质释放等功能[38]。 A/A组合协同降低甲基胞嘧啶水平，从而增强幼稚多能干细胞代谢重新编程。维生素A和维生素C均能通过下调DNA甲基转移酶水平来诱导NKG2DLs表达并抑制肿瘤细胞甲基化，并通过促进肿瘤细胞与自然杀伤（natural killer，NK）细胞的结合来提高肿瘤细胞免疫靶向作用，对TET2或TET3突变型肿瘤有较好疗效[39]。A/B组合代谢基础是维生素B族的活性形式硫胺素焦磷酸（thiamine pyrophosphate，TPP）是丙酮酸脱氢酶复合体、α-酮戊二酸脱氢酶复合体和磷酸戊糖途径的转酮醇酶反应的重要辅助因子，体内氧化还原反应主要成分NADH、NADPH和谷胱甘肽都是在以TPP为辅助因子的酶促反应过程中产生，维生素B族在调控细胞葡萄糖代谢、维持氧化代谢平衡与维生素C有协同抗瘤作用[40]。 3.5 大剂量维生素C联合程序性死亡受体1/程序性死亡配体1抑制剂 HVC提高肿瘤细胞程序性死亡配体1（programmed death ligand-1，PD-L1）表达，联合程序性死亡受体1（programmed death receptor-1，PD-1）/PD-L1抑制剂治疗肿瘤可获得更好效果，而且这种协同作用依赖于CD8+T细胞浸润，其机制与HVC激活cGAS-STING通路有关[41]。cGAS是先天性免疫系统的DNA感受器，HVC产生ROS激活cGAS后，促进其第二信使cGAMP分泌并激活下游干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）分子。由于STING主要在肿瘤血管内皮细胞高表达（肿瘤细胞不表达），HVC激活的是内皮细胞STING通路（内皮激活）。内皮激活是血管正常化的重要标志，可促进肿瘤血管正常化和淋巴细胞黏附分子的表达，导致CD8+T细胞浸润，最终诱导获得性抗肿瘤免疫反应[42]。HVC可作为STING激动剂联合PD-1/PD-L1抑制剂治疗肿瘤。 3.6 大剂量维生素C联合溶瘤病毒治疗 溶瘤病毒（oncolytic virus，OVs）是一类能选择性感染和溶解肿瘤细胞的病毒，由于其具有局部杀伤肿瘤细胞和诱导全身抗肿瘤免疫反应双重作用，已成为一类有吸引力的新型肿瘤免疫治疗药物。然而，OVs易被抗病毒抗体和细胞毒性T细胞介导的免疫反应快速清除，以及间质高压和细胞外基质等物理屏障因素阻止OVs感染肿瘤细胞等原因，OVs单一疗法效果有限。ROS是调控ICD细胞内通路的重要组成部分，HVC可诱导肿瘤细胞产生大量ROS，与OVs联合可成为肿瘤HVC强化治疗的新策略。①HVC诱发的ROS增高介导钙网蛋白从胞质向胞膜转移、上调细胞HSP90和高迁移率基团盒两种ICD标志物表达，促进树突状细胞（dendritic cells，DC）成熟和激活，延长和增强OVs触发的ICD效应。②HVC增强OVs对肿瘤细胞的感染率和溶瘤能力，而OVs强化HVC诱导的过氧化应激效应，OVs在肿瘤细胞中进行选择性复制，严重干扰细胞抗氧化功能引起ROS持续升高。③HVC和OVs均能激活DC和CD8+T细胞，减少M2-TAM和Treg数量，将免疫抑制型TME转化为免疫允许型TME，“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”。动物实验显示HVC和OVs联合可抑制肿瘤生长和转移，导致30%的CT26荷瘤鼠和20%的4T1（一种肿瘤细胞株）荷瘤鼠肿瘤完全消退[43]。 3.7 大剂量维生素C联合中药治疗 整体观和辨证论治赋予了中药多靶点、多途径时空协同调控肿瘤代谢的天然优势，中药也能从多环节、多层级协同HVC治疗肿瘤。清热解毒药通过调控肿瘤细胞线粒体功能增强HVC的促氧化应激效应，活血化瘀药干预肿瘤脂质代谢促进HVC的表观遗传修饰作用，而扶正固本药则主要调控氨基酸代谢提高HVC免疫抑瘤效果。HVC联合中医药强化治疗具有前景。 4 展望
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