  双光子荧光成像技术由于其优越的时空分辨率，在诊断学和生物医学领域受到广泛关注。其中，双光子探针作为造影剂，在复杂的生理环境下实现高效发光是该高信噪比成像技术的关键。为了满足这些需求，多年来人们一直致力于优化发色团的化学结构或者构筑纳米探针。然而，由于不可控聚集而导致的荧光淬灭以及应用过程中的光氧化漂白依旧是双光子探针发展面临的重大挑战。因此，设计具有优异发光性能的生物兼容双光子探针，使其不受聚集和光氧化的影响，是实现生物体内双光子成像需关注的科学问题。近日，中国科学院过程工程研究所闫学海课题组通过共组装方法，调控氨基酸衍生物与近红外花菁分子制备了纳米探针，在该领域关键科学问题的突破中取得进展，相关研究成果发表在Nat. Commun.（DOI: 10.1038/s41467-023-40897-4）。近红外花菁双光子纳米探针的制备、应用及机理示意图（来源：Nat. Commun.） 发展具有光氧化增强发光机制的生物有机双光子纳米探针 双光子成像由于其高时空分辨率、低焦点外光漂白及自体荧光、高组织穿透等特点在生物诊疗领域显示出独特的优势。在该成像技术的应用中，使用兼具生物相容性与高效发光性能的双光子探针，可以实现对生物体细胞水平、组织水平以及生物本体水平生命活动的探究。近年来，为了满足这些需求，人们一直致力于提升探针的成像性能：优化分子探针结构或者构筑纳米探针。然而，这些探针在生物应用的过程中依旧面临如下问题：（1）有机双光子分子探针或纳米探针的可持续发光在光照射过程中受到光氧化漂白影响，降低造影效果；（2）由于大多数分子发色团为共轭结构连接供受体，发色团疏水性较强，导致聚集诱导荧光淬灭；（3）现有的双光子探针——不管是大分子探针或者无机纳米材料，由于繁琐的合成路线或潜在的毒性等问题，限制了其在体内的安全应用。因此，设计具有优异发光性能的生物兼容双光子探针，使其不受聚集和光氧化的影响，对于实现生物体内成像应用尤为重要。为了开发新型的双光子探针，闫学海课题组近期采用共组装策略，通过氨基酸衍生物调控与近红外花菁分子间作用力制备了双光子纳米探针。该课题组之所以聚焦于近红外花菁分子，是因为该类分子具有较高的摩尔消光系数，且已应用于临床成像诊断。该类分子结构特点为由多次甲基共轭连接两个含氮杂环，其中，一个氮原子上的正电荷与第二个氮原子产生共振离域，使得整个分子具有电荷离域的特点，反应了其非线性极性光学潜质。此外，该课题组在超分子自组装领域具有丰富的研究经验，并且该策略也是发展具有新型光物理化学性能纳米材料的常用方法。基于此，该课题组将氨基酸衍生物与近红外花菁分子作为组装基元，调控其共组装形成纳米探针。纳米聚集结构的形成，不仅增强了单体双光子吸收性能，并且在应用过程中表现出光氧化增强发光的性质。该性质显著区别于光氧化淬灭的传统探针，提供了一种新型双光子纳米探针的设计思路。具体地，该课题组首先选用组氨酸衍生物ZHO分别调控近红外花菁分子ICG、IR140和IR806的组装，进一步引入Zn2+配位作用，得到结构稳定的纳米探针。且所得纳米探针粒径分布均一，均为球形纳米结构。双光子纳米探针的形貌表征（来源：Nat. Commun.）接下来，该课题组比较了近红外花菁分子在单体及纳米探针状态下的发色团变化情况。与单体态相比，纳米探针的吸收光谱红移，证明了非共价相互作用促进了电子离域；同时，探针对应的近红外荧光淬灭，而基于双光子吸收的上转换荧光显著增强。通过比较不同的近红外花菁分子聚集体，证明了聚集状态是增强双光子吸收的关键。进一步，以ICG NPs为例，该课题组进行了更为系统的探究。ICG NPs表现出良好的抗光漂白稳定性，而free ICG则表现为快速光降解。通过相同的方法构筑罗丹明纳米探针RhB NPs作为对比，对双光子吸收截面TPACS进行了表征，结果表明：ICG NPs的TPACS表现出吸收波长依赖性，在808nm处的TPACS明显高于free ICG以及对照组RhB NPs和free RhB。双光子纳米探针的光学性能表征（来源：Nat. Commun.）该课题组进一步探究发现，ICG NPs与free ICG表现出相反的光氧化发光行为：ICG NPs在含氧量较高的氛围中，其发光强度表现出逐渐增强的性质；而free ICG则在含氧量较高的氛围中逐渐光氧化降解。分析二者的吸收光谱发现：含氧量越高，无论是ICG NPs还是free ICG都表现出更低的吸光度。对于free ICG而言，该现象是正常的，即吸光度的牺牲对应于发色团的降解；而对于ICG NPs而言，吸光度的降低越明显，其对应的发光强度越高，这种相悖的现象促使作者推测：ICG NPs这种光氧化发光增强的行为是由一种不稳定的中间产物介导的。双光子纳米探针的光氧化增强发光性质（来源：Nat. Commun.）因此，该课题组对中间产物进行了系统探究。首先，将发光过程分为初始、增强、降解三个阶段。对三个阶段的探针形貌进行表征，结果表明：与初始阶段相比，增强阶段ICG NPs之间的粘附性增强，且呈现出核壳结构；这种结构在降解阶段消失，由此推断ICG NPs的降解是从外向内逐渐进行的，在此过程中，伴随着导致荧光发射增强的不稳定中间体的产生。由于氧气在其中扮演重要作用，通过顺磁光谱证明了氧气以单线态氧1O2的形式参与增强发光过程中。结合傅里叶变换红外光谱、质谱，推测出由1O2连接的ICG分子二聚体为可能的中间体结构。分子动力学模拟也支持作者的假设：ZHO介导的ICG共组装，形成聚集体结构，其中，ICG分子间较小的分子间距，促进了双光子吸收的电子离域；在光激发过程中，通过能量转移形成的1O2连接ICG分子间的碳碳双键，得到的含氧二聚体结构进一步扩大利于双光子吸收的电子离域，最终增强荧光发射。双光子纳米探针光氧化增强发光机制（来源：Nat. Commun.）最后，该课题组对ICG NPs的细胞及动物层次水平应用进行了探究。细胞层次结果表明：ICG NPs的成像信号明显优于对照组RhB NPs，这主要归功于ICG NPs独特的光氧化发光性质及优异的光稳定性。动物层次成像结果表明：ICG NPs可以在不同的肿瘤模型中实现三维立体成像，且其成像信噪比明显优于RhB NPs。此外，ICG NPs还可实现其在肿瘤部位的实时累积、富集过程的动态监测。该研究开发了近红外花菁分子的体内外双光子成像新应用，在临床诊断领域显示出应用潜力。双光子纳米探针的体内外成像应用（来源：Nat. Commun.）该工作近期发表在《自然通讯》上（Nat. Commun. 2023, DOI: 10.1038/s41467-023-40897-4），中国科学院过程工程研究所博士后李淑坤为第一作者，中国科学院过程工程研究所邢蕊蕊副研究员和闫学海研究员为通讯作者。该研究工作得到了国家自然科学基金委、中国博士后科学基金会的大力资助。课题组主要从事肽、蛋白质等生物分子组装与生物医学应用的基础研究和应用研究。从分子到纳微尺度等多层次上研究材料和药物制剂的结构形成及与功能间的内在关联，发现和揭示生物分子组装的新现象、新机制，开发功能组装体在生物医药领域的创新性应用。1）肽、蛋白质等生物分子组装机制和多尺度过程规律，发展生物材料和药物制剂的可控制备技术；2）氨基酸、肽等生物分子玻璃态结构，发展局部和口服微环境响应递药系统以及可降解植入器件；3）组装体药物、智能纳米药物、肽组装疫苗、生物催化剂、肿瘤成像及肿瘤光免疫疗法等新技术。详见课题组主页http://www./cn/。另外，课题组长期招聘博士后科研人员，有兴趣者可直接联系Email: yanxh@ipe.ac.cn。第一作者：李淑坤，中国科学院过程工程研究所博士后、欧盟玛丽居里学者。2021年于中国科学院过程工程研究所获博士学位，师从闫学海研究员。2021年获中国博士后管理委员会“国际交流计划”派出项目资助，赴荷兰埃因霍温理工大学从事博士后研究，合作导师为欧洲科学院院士Jan van Hest教授。主要研究方向为超分子自组装材料及肿瘤诊疗应用。通讯作者：邢蕊蕊，中国科学院过程工程研究所副研究员、硕士生导师，中国科学院青年创新促进会成员，生化工程国家重点实验室、生物剂型与生物材料研究部主任助理，Colloids and Surfaces A助理编辑。主要研究方向为生物分子自组装与生物医学工程，包括肽、蛋白质等生物分子自组装和超分子作用机理，生物医用材料与生物剂型的可控制备技术等。通讯作者：闫学海，中国科学院过程工程研究所研究员、博士生导师，生化工程国家重点实验室副主任。于2020年获国家杰出青年科学基金，2018年入选科技部中青年科技创新领军人才，2015年获国家优秀青年科学基金。课题组主要研究领域为生物分子组装与生物医药应用，研究内容包括肽/蛋白质新材料、新制剂，生物可吸收器件，抗炎、抗菌、抗肿瘤生物医药新技术等。
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