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作者：崔格格，南京农业大学硕士在读，主要研究根际资源与微生物互作
化感作用与植物和/或微生物互作密切相关，自毒是化感作用的一种独特形式，植物通过这种形式向环境中释放的化感物质对其自身生长和发育不利。甘草是中国最重要的传统中草药之一，近年来随着药材需求增加，因连作种植造成的植物化感现象，对植物生长、产量和品质产生负面影响，严重制约中药农业生产的发展。化感作用与根际生物过程密切相关，根际微生物群落对植物发育至关重要，但目前化感物质对甘草根菌群落的影响尚未得到更深入的研究。宏基因组学领域的进步使得在复杂环境中对个体社区成员的基因组进行分类成为可能。因此，作者采用组学测序方法和盆栽接种实验相结合的方法，(1)研究外源化感物质(甘草酸)的添加对甘草植物、土壤特性、根际细菌多样性和功能的影响;(2)阐明了根际细菌接种剂对甘草幼苗性能的影响。 1．添加化感物质对甘草和土壤特性的影响 作者设置3个处理，A：添加外源化感物质处理，W：添加水处理，N：对照组。结果表明外源化感物质(甘草酸)对植物的生长性能有显著影响(图1a)。水处理鲜叶叶绿素含量、鲜茎重和鲜根重均显著高于外源化感物质处理。植物发育的初期到中期和末期，所有的植物表型指标都是逐渐增加的(图1b)。化感物质处理在中后期抑制了部分甘草酸合成基因的表达水平，提高了luphil合成基因(LUS)的表达水平。在最后阶段添加外源甘草酸促进了CYP72A154和CHS的表达水平(图1c)。从甘草根系主要次生代谢物合成基因的表达来看，外源甘草酸在一定程度上抑制了甘草的发育。根际土壤pH值随甘草生长而显著升高，化感物质处理下pH值更高，水处理的SWC值显著高于化感化学处理，化感物质处理的SOM和TC值显著高于水处理。此外，尽管不同阶段和处理的土壤性状(全氮、全磷、全钾、有效氮)没有显著差异，但大块土壤的全氮值高于根际土壤，化感物质处理根际土壤速效钾显著高于水处理。两种土壤酶的活性在两个土壤区室之间无显著差异，其活性普遍受到外源甘草酸添加的抑制。
图1. 外源添加甘草酸对甘草幼苗表型及根系主要次生代谢物合成基因表达的影响 三种处理的Shannon指数和ACE指数具有显著性差异(P<0.05)。水处理多样性较高，根菌群落多样性高于土壤整体多样性，且三种处理对土壤整体群落组成的影响大于对根际土壤群落组成的影响(图2a)。在化感物质处理的中后期，大部分根际细菌类群都是共同富集的，根据来自不同类群的共富集类群的交集选择共有类群(图2b)。发现根际细菌多为鞘脂单胞菌科Sphingomonadaceae(图2c)，且在网络中为关键节点，鞘脂单胞菌科是一个关键分类单元。总体而言，外源甘草酸的添加显著影响了根际细菌的α和β多样性，并招募了部分根际细菌。
图2. 外源添加甘草酸对根细菌群落的影响 3．接种剂的分离与构建 作者利用宏基因组测序技术进一步探索根菌群落的功能变异。结果表明与前期相比，化感物质处理在后期和中期分别显著富集了146和145条通路相关基因 (图3a)。参与环状化合物降解的基因丰度略高，组合类群中新鞘脂菌属Novosphingobium的丰度最高(图3b)。为了探索上述富集和组装的根际细菌的功能，作者纯化分离得到的4株菌株，并命名为E、Na、N和H。发现在培养中，单个N菌株的降解率最高(87.94%)，其次是E、Na和H。然而，菌株之间的降解代谢产物相似，包括人参皂苷Rh、人参皂苷Rh2、白桦酸、齐果酸和熊果酸，以及一些甾体化合物。 此外，对4株菌株进行了全基因组测序后发现壳基因组中存在一组辅助基因和特异性基因参与环状化合物降解。值得注意的是，与其他菌株相比，N和E菌株与更多外源物质生物降解和代谢基因相关(图3c, d)。此外，它们的平均核苷酸同源基因组信息具有更高的相似性(N: 84.4%;E: 84.2%)。根据平板培养实验，两株菌株之间不存在营养竞争和拮抗。鉴于根际细菌N (Novosphingobium resinovorum)和E(Ensifer sesbaniae)在根际中富集且它们具有相对较高的化感化学降解率，作者组合了两株根际细菌(N + E)作为合成接种剂(S)，合成菌剂在混合培养中的化感降解率高达92.95%。
图3. 根细菌群落的宏基因组分析及4个分离株的基因组信息 4．细菌接种剂对甘草性能的影响 随后作者进行了盆栽试验，验证上述单一和合成细菌接种剂对甘草幼苗性能的影响。从植株表型来看，化感物质处理抑制了甘草幼苗的发育(图4)。所有接种剂的幼苗生长指数均高于无接种剂的幼苗生长指数，且化感物质处理下N单菌株的幼苗生长指数最高，不同处理间鲜重具有显著差异(P<0.05)。其中，单菌株N和E分别促进了化感物质处理和水处理中甘草酸合成基因HMGR、β-AS、CYP88D6的表达谱，但单菌株N对水处理中luphil合成基因CYP72A154、LUS、CHS的促进作用较强。此外，接种后根际土壤化感物质含量显著低于无细菌接种剂处理(P<0.05)。化感物质含量最低的是单株菌N(34.94%)和E(20.19%)。除初始样品外，化感物质处理中添加N菌接种剂和水处理中添加E菌接种剂的N菌株数最高。综上所述，根际细菌接种剂对甘草的潜在保护作用很可能是其在根际土壤中的定殖和化感降解能力。
本研究证明外源甘草酸会抑制甘草的发育，并丰富了与甘草酸降解相关的特定根际菌和相应的功能。此外，新鞘脂菌Novosphingobium在富集类群中所占比例较高。作者进一步表征了单一和合成接种菌剂降解甘草酸的不同能力，发现它们可以不同程度的减轻甘草化感作用。其中，单菌株N (Novosphingobium resinovorum)接种剂对甘草幼苗化感作用的缓解效果最好。总之，外源甘草酸模拟了甘草的化感自毒作用，而单一细菌N在保护甘草生长免受化感作用方面的作用比合成接种剂更大。本研究结果增加了对甘草化感作用过程中根际菌群落动态的研究，对利用根际菌生物肥料解决药用植物连作障碍具有潜在的指导意义。 论文信息 原名：Metagenomics insights into responses of rhizobacteria and their alleviation role in licorice allelopathy 译名：根际细菌的宏基因组学研究及其在甘草化感作用中的缓解作用 期刊：Microbiome DOI：10.1186/s40168-023-01511-3 发表时间：2023.05 通讯作者：焦硕、韦革宏 通讯作者单位：西北农林科技大学 |
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