【原】【LorMe周刊】微（纳米）塑料促进了人工湿地中抗生素抗性基因的水平转移

LorMe青年 2023-09-20 发布于江苏

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作者：朱迪，宁波大学硕士在读，主要研究方向为人工湿地中生物性污染物的环境过程。

LorMe周刊每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍对微（纳米）塑料（MPs/NPs）的存在对ARGs的水平转移和相应宿主群落的影响探究，原文于2023年8月发表在《Water Research》。

导读

人工湿地（CWs）已经被确定为是水生环境中微（纳米）塑料（MPs/NPs）和抗生素抗性基因（ARGs）的重要来源。然而，关于MPs/NPs的存在对ARGs的水平转移和相应宿主群落的影响知之甚少。本研究将携带RP4质粒编码的ARGs的工程荧光大肠杆菌添加到CWs中来研究不同尺寸的聚苯乙烯（PS）颗粒对ARGs转移的影响，通过激光扫描共聚焦显微镜观察了耐药细菌（ARB）和质粒携带ARGs在湿地中的传播情况，利用分子测序方法分析了MPs/NPs的存在对CW中ARB结构的影响。结果表明ARGs可以以MPs/NPs为载体以依赖尺寸的方式转移并传播到CW微生物组中。本研究结果强调了MPs/NPs的存在会引起较高的ARGs传播风险，并强调需要更合理的塑料处置以防止潜在的健康威胁。

主要结果

1、 PS颗粒以依赖尺寸的方式促进ARG通过水平基因转移（HGT）进入CW微生物

CW基质、根际和水样中的gfp和mCherry的丰度和分布模式差异表明，在CW系统中发生了RP4质粒HGT（图1）。与根际和水相比，对照、4 mm、100 μm和100 nm四组处理中基质中相关gfp基因浓度高于根际和水样（图1B）。共聚焦显微镜观察到在CW中的绿色荧光细菌中呈现出相似模式（图2），表明HGT常发生在CW基质中。根据图1A的结果，在所有处理中，无论是否存在PS，根际的mCherry丰度都显著高于基质和水，推测根际不仅是大肠杆菌生长的碳源，也是生物地球化学转化的热点。

此外，PS颗粒通常以尺寸依赖的方式促进ARGs的HGT。如图1B所示，与对照组相比，PS处理组中的gfp丰度更高，表明PS颗粒可促进ARGs的HGT。在100 μm的PS组中，gfp丰度最高。同时，通过共聚焦显微镜观察到，存在100 μm的PS颗粒时绿色荧光细菌的密度显著增加，而100 nm的PS对ARG转移的促进作用比100 μm组较弱。上述结果表明PS颗粒的尺寸对ARG传播有复杂的影响。

图1 （A）mCherry基因和（B）gfp基因在人工湿地的基质、根际和水体中的分布

图2 人工湿地基质、根际和水中的红色荧光大肠杆菌供体菌株和绿色荧光细菌的共聚焦显微镜图像

2、 PS颗粒改变了细胞膜通透性和细胞活性

为确定不同粒径的PS对细胞损伤的影响，作者测定了CW基质、根际和水样中微生物的ROS生成。发现受体细胞ROS水平增加程度与PS颗粒尺寸显著相关，尤其是在100 nm的PS存在下(p < 0.05，图3A)。通过乳酸脱氢酶（LDH）法测定受体细胞膜通透性发现，PS处理组基质、根际和水体的细胞膜通透性显著增加(p < 0.05，图3B)。结合ROS和细胞膜通透性的结果发现，较小尺寸的PS颗粒更有利于促进ARG转移。然而，与100 μm PS组相比，100 nm的PS组对ARG转移的促进有限。这可能是因为纳米塑料可以有效穿过细胞膜，造成细胞损伤并降低细菌活力。

进一步使用CCK-8测定进一步测量细胞活力。结果显示，100 nm的PS颗粒显著降低了细菌的生存能力 (p < 0.05)。100 μm的PS颗粒可作为微生物载体，可以招募更多的供体菌株和CW受体群落，从而促进ARG的交换 (图1B)，而100 nm的PS颗粒由于其毒性作用而抑制了细菌的定殖。100 nm组水样中绿色荧光蛋白丰度和绿色荧光细菌数量最多(图1B和图2)。

图3 相对(A)ROS含量，(B)渗透性和(C)细胞活力

3、 CWs中携带ARGs的细菌群落的变化

基于Bray-Curtis差异性的聚类树状图将携带RP4的细菌群落分为介质和颗粒尺寸依赖型（图4A）。PCoA分析表明PS颗粒影响下，携带RP4的细菌群落对PS颗粒的尺寸变化具有强烈的依赖性（图4B、C、D）。100nm的PS处理组中， OTUs数和Shannon指数均有所增加，尤其是在根际，表现出最高的OTUs数和多样性（图4E、F）。携带RP4质粒类的细菌促进了PS颗粒对ARGs和HGT的影响。在携带RP4质粒的前30个优势属中，有15个属属于变形菌门，且在PS颗粒处理后的各CW中呈现显著差异（p<0.05，图5），表明PS颗粒可能有助于CW中的门内细菌间的ARG转移。进一步证实MPs/NPs在形成ARB群落中起着关键作用，并促进了ARG在CW环境中向病原菌转移，对人类健康构成潜在威胁。

此外，在CW中， PS颗粒的存在也改变了携带RP4质粒的氮转化细菌群落结构（图6）。与对照组相比，100 μm和100 nm的PS颗粒处理下， CWs中携带RP4质粒的硝化和微杆菌属的相对丰度均显著增加(图6A-B)，而反硝化菌显著下降，异化型氮还原菌和固氮菌受影响较小（图6C-E）。综上所述，对比携带RP4质粒的硝化菌和反硝化菌对PS颗粒的响应模式发现PS暴露下它们存在不同的生存策略。

图4（A）系统发育树显示了在暴露于不同尺寸的塑料颗粒的情况下，在人工湿地的基质、根际和水中具有获得的RP 4质粒的微生物群落的聚类模式。主坐标分析图分别描绘了在（B）基质、（C）根际和（D）水体的不同塑料颗粒暴露下的Bray-Curtis距离。（E）人工湿地不同介质中OTU数量和（F）Shannon多样性指数的箱形图

图5前30种细菌属的平均相对丰度

图6（A）硝化菌、反硝化菌、异化氮还原菌和固氮菌的平均相对丰度。不同处理下所得质粒中(B)硝化菌、(C)反硝化菌、(D)异化氮还原菌和(E)固氮菌的总相对丰度。

4、PS颗粒促进了携带ARG的核心细菌在湿地中的共享

三元图（图7A-D）进一步揭示了PS颗粒促进RP4质粒传播到CW中的机制。与对照组相比，在100 μm的PS颗粒影响下，基质和根际中独有的OTU数量不成比例地增加（图7E）。此外，基质与根际、基质与水体、根际与水体之间共享的OTU数量也有显著差异（图7中数字4、5和6）。这说明在100 μm的PS颗粒加强了基质、根际和水体微生物之间的联系，可能导致ARGs从基质和根际扩散到CW出水甚至受纳水体环境中。此外，所有CWs中共享的核心OTU是主要携带RP4质粒的微生物，在对照组、4mm、100 μm和100 nm组中分别占46.38%、51.15%、64.45%和58.23%（图7中数字7）。上述结果表明100 μm的PS颗粒能够促进ARB在CW基质、根际和水体中的迁移。

图7通过(A)对照、(B)4 mm、(C)100 μm和(D)100 nm PS暴露处理，获得的RP4质粒的细菌OTU在人工湿地基质、根际和水体中的分布情况。

结论

本研究结果表明CW中的基质、根际和水体中，MPs/NPs以尺寸依赖的方式显著促进了ARGs的转移。PS微粒是微生物定殖的有效载体，对携带ARGs的质粒在CW中的扩散有重要作用。100 µm的PS颗粒可以招募病原菌和硝化细菌以获得ARGs，而纳米级PS颗粒对CW微生物组具有毒性作用，导致对ARG转移的促进作用有限。值得注意的是，MPs/NPs还改变了CW中携带ARG质粒的细菌群落的组成，并促进了携带ARGs的核心细菌在人工湿地各部分之间的共享。未来需要更多地关注来自处理过的废水中MPs/NPs和ARGs的排放，以减少ARGs扩散对水环境的污染。