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慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，基因组为双链RNA。但区别于一般的逆转录病毒，慢病毒具有更广的宿主范围，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 重组慢病毒载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的工具载体，其毒性基因已经被剔除并被外源目的基因所取代，属于假型病毒。（一次性感染能力而无复制产生新病毒能力） 将靶基因随机整合到宿主的基因组中，并且能够在细胞系中稳定表达若干代，可以进行稳转细胞株的筛选。被广泛应用于各种细胞系基因敲除、基因过表达、RNA干扰。1. 慢病毒载体 慢病毒载体：该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pLVX-CMV-EGFP-gene或者pLKO-U6-shRNA-EGFP-puro。其中pspax2, pMD2G是辅助质粒，另一个是骨架载体，骨架载体上的EGFP能表达绿色荧光蛋白（GFP），过表达的基因以及敲低序列shRNA均构建在慢病毒骨架载体上；2. 细胞 293T细胞；慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)，贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞；3. 菌株 大肠杆菌菌株DH5α或者stbl3，用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 （1）构建含有目的基因的病毒载体，抽提高浓度、高纯度的包装质粒和目的质粒;（2）指数生长的293T细胞(培养条件：DMEM+10%FBS, 37°，5%CO₂)；（3）试剂：胎牛血清、DMEM、Opti-MEM、lipo2000等；（4）仪器设备：荧光显微镜、生物安全柜、超速离心机等。以293T细胞为例： 转染前一天，将已经长好的细胞以合适的比例传代到10cm培养皿中，当细胞长到80%时准备转染，步骤如下：（1）弃去培养液，加入5 mL 灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去 PBS 溶液。（2）用2 mL 胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞。（3）以含10%血清的培养基调整细胞密度为5 ×10^6个/10 mL，重新接种于10cm细胞培养皿中，37 ℃，5% CO₂ 培养箱继续培养，转染前细胞密度80%左右。 注意：293T细胞的状态非常重要，一般建议购买新的细胞株后分批多次冻存，以保证每次包装病毒时细胞的代数不会超过10代。同时尽量不要使用国产血清。复苏后的细胞需要传2代后才能进行病毒的包装，并且传达后18-24h需要密度达到80%左右。转染前1~2h 将需要转染的细胞换新鲜的培养基，8mL/10cm皿。注意：293T细胞贴壁性不是很好，换液时应小心滴加尽量避免冲起细胞。（1）以一个10cm平皿为例，取2个EP管，分别加入500 µl生理盐水，标记为A、B；（2）A管加入60µg PEI，并充分涡旋混匀，B管加入过表达质粒和两个辅助质粒pSPAX2、pMD2.G，三质粒比例为4：3：1，共24µg；（3）将A管PEI加入到B管中,轻轻混匀，静置20min；将混合液加入细胞中，过夜培养。注意：质粒提取的质量，包括浓度和纯度。浓度至少要超过500ng/ul，因为浓度低，加入的体积就会相应增大，会增加细胞污染的风险。纯度可以使用核酸测定仪进行检测，260/280在1.8-2.0之间。有条件的可以选择去内毒素试剂盒进行提取，会对病毒的产量有帮助。同时，由于辅助质粒使用频率高，可以选择进行大提，分装低温保存，保证后续包病毒质粒的稳定性。 转染过夜后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加10mL新鲜的细胞培养基继续培养。注意：此时弃去的培养基中已含有少量的病毒，必须经处理后才能丢弃，所用的移液枪头等必须经消毒液浸泡至少15min后才能丢弃。 加入的新鲜培养基一般选择FBS浓度为2%-5%，可以根据细胞的生长状态来选择。 换液后48h，收集细胞上清液于50mL离心管，4度保存。并根据细胞生长状况适当补充新鲜细胞培养基（含2%-5% FBS的DMEM）。24h后再次收集细胞上清液于同一个50mL离心管。4℃，4500g离心20min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管。过滤后的细胞上清液如果暂时不进行进一步处理，请及时于-80℃储存。注意：细胞转染后24h就可以看到荧光蛋白的表达，48h可以进行荧光照片的采集，判断转染效率。一般为了能获得高滴度的病毒，需要通过不断优化条件，提高转染效率。优化条件包括：三质粒的比例优化，转染试剂的优化，细胞培养条件的优化等。病毒过滤后需进行浓缩，采用PEG8000方法浓缩病毒；（1）5X PEG8000 —NaCl配制：称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭菌 30min；保存在4℃；（2）每30ml过滤后的病毒初始液，加入5X PEG-8000 —NaCl母液7.5 ml；（3）每20～30min混合一次，共进行3-5次；（6）吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；（8）溶解后的病毒悬液分装成小份，保存于-80 ℃，避免反复冻融。注意：试剂尽量选择sigma公司，同时需要保证配置的准确性。离心后可以直接看到病毒沉淀，吸走液体时要小心，不要吸走了沉淀。溶解时如果发现很难吹打，可以适当的静置一会再去吹打混匀。病毒溶解后需要及时分装保存，避免使用时反复冻融。 （1）将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×10^5/ml，加入96孔板，100μl/孔。放入37℃，5%CO₂培养箱中培养；（2）在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入900μl培养液，往第一个管中加入100μl病毒原液，混匀后，吸取100μl加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度，每个稀释度做4个重复孔；（3）吸取96孔板中原有的培养基，加入稀释好的病毒液100μl；（4）两天后在每个孔再加入100μl完全培养液，利于细胞的生长；（5）第五天在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y*10）*1000/2/X孔的病毒液的含量（μl）。注意：浓缩后的病毒可以适当将起始稀释度增大，避免病毒的浪费。条件允许的情况下可以每个稀释度多做些重复，保证实验结果的可靠性。病毒滴度是在293T细胞上测定的，不代表其感染其它细胞的能力。所以当病毒感染其它细胞时，需要多做几个MOI的梯度，以确保感染效果的最佳化。
慢病毒感染293T细胞 我们可以为您提供研究所需敲除质粒载体构建和慢病毒包装服务。我们的慢病毒载体来源于HIV-1病毒，序列经过精心优化，提高了生物安全性、基因表达水平和病毒转导效率。慢病毒可将特定基因片段随机、稳定地整合到宿主细胞的基因组中，实现目的基因的持续稳定的表达目的产物，因此，目前慢病毒载体已经广泛地应用于基因的表达调控如过表达，干扰和基因敲除。
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