   真菌是系统发育树上一个独特的、多样的、具有重要生态意义的分支，它们能产生大量的生物活性分子，在农业、工业和制药领域发挥着非常重要的作用。然而，鉴定真菌仍然是一项艰巨的任务。这篇文献作者讨论了： 01 单形态学用于真菌物种鉴定的问题 02 真菌鉴定中最常用的三个核糖体基因 03 如何使用NCBI-BLAST进行真菌鉴定 04 利用DNA序列构建系统发育树鉴定真菌   01 单形态学用于真菌物种鉴定的问题 真菌学家传统上使用形态学作为鉴定真菌种类的唯一手段，例如无性繁殖(有丝分裂)或有性繁殖(减数分裂)形成的产孢子结构。形态学在真菌种类鉴定中的应用对了解真菌形态特征的演变具有重要意义。但是在一些高度物种化的真菌谱系中，即使是训练有素的真菌学家，形态学特征也可能是有争议的或有问题的，因为它们可能并不总是在进化框架内提供准确的分组，主要是在种水平上。 此外，在真菌学中，同一真菌的无性和有性阶段，大多数时候会使用不同的名称(称为双重命名法)，直到最近，根据最新的国际藻类、真菌和植物命名规则，这种做法不再被接受。此外，仅根据形态学鉴定真菌可能存在一定的困难，特别是当经验不足的人员处理真菌培养物时，可用于鉴定的形态学特征数量有限。例如，通常用于分离次生代谢物的内生真菌菌株，在培养中并不总是产生孢子，因此无法提供基于形态学识别它们的表型特征。对于在培养中产生孢子的真菌，其无性结构，如分生孢子/孢子的形状和大小，通常可以表现出高度的可塑性，也使得物种鉴定具有挑战性。因此，基于DNA水平的鉴定方法可以帮助识别更多的真菌物种。  真菌基于DNA水平的鉴定方法图 (图片来自此文献) 02 真菌鉴定中最常用的三个核糖体基因 20多年前，White等人发表了一篇描述真菌核糖体操纵子引物的论文，利用这些引物产生的真菌DNA序列包括大亚基(nrLSU-26S或28S)、小亚基(nrSSU-18S)和整个内部转录间隔区(ITS1、5.8S、ITS2)，开启了真菌分子系统发育分析和序列鉴定的新时代。 三个不同区域的进化速度不同，遗传变异水平也不同，其中SSU进化最慢，类群间变异最少，ITS进化最快，变异最大。LSU区域包含D1和D2高变结构域，单独或与ITS区域结合，对真菌的物种鉴定也很有价值。对于种水平的鉴定，ITS是最有用的，因为它是rRNA顺链中进化最快的部分，但ITS也存在争议，并不适用于一些高度物种化的属，如曲霉属、枝孢菌属、镰刀菌属、青霉属和木霉属等。此外，利用ITS区域确定物种的特异性临界值仍在评估中，没有一个单一的值可以适用于所有群体。  大亚基和小亚基扩增引物图 (图片来自此文献) 03 如何使用NCBI-BLAST进行真菌鉴定 ITS序列片段可以单独在GenBank中使用BLSAT进行身份验证。BLAST搜索通常使用BLASTn。有几种方法可以进行限制BLAST搜索，来改善结果，例如将BLAST搜索仅限于RefSeq序列。由于缺乏一个确定的百分比序列相似性，可以精确地表明同种分类群，过去，真菌学家使用任意截断值≤3%至5%来表示ITS序列差异，以表明真菌之间的同一性。对于BLAST搜索，基于对GenBank和BLAST搜索结果的考虑，在分配物种名称时，查询覆盖率≥80%，序列相似性≥97-100%(即序列差异高达3%)是合理的，因为真菌界的平均加权ITS变异性为2.51%，标准差为4.57%。 使用GenBank BLAST搜索的局限性，由于大约27%的GenBank真菌ITS序列提交的分类鉴定不足，因此建议对GenBank进行BLAST搜索鉴定时应谨慎进行。此外，GenBank中约有20%的真菌序列可能被错误注释，其他的问题还有： (1)GenBank不允许第三方对记录进行注释(但如果记录明显被错误识别，可以从BLAST中删除)。 (2)由于真菌分类学性质的快速变化，分类名称并不及时； (3)迄今所描述的大多数真菌物种(约70%)尚未被测序 (4)模式菌株没有明显或明确的指示。 (5)许多序列未命名或仅部分命名。 由于内含子区域的存在，某些蛋白质编码基因被用于物种鉴定，与ITS相比，内含子区域的进化速度更快，在更高的分类水平上具有更好的分辨率，被用于系统发育分析。RNA聚合酶的最大亚基(RPB1)和第二大亚基(RPB2)，翻译延伸因子1-α(tef1)，β-微管蛋白(tub2/BenA)最常用于分析真菌之间的系统发育关系。有几个精心整理的数据库专门用于鉴定ITS和其他核糖体和蛋白质编码序列。  真菌物种鉴定数据库目录表  用分子系统发育分析鉴定真菌的流程图 (图片来自此文献) 04 利用DNA序列构建系统发育树鉴定真菌 与BLAST比对鉴定不同，DNA分类学是以利用不同个体序列间固有的遗传变异来识别分类群为前提的，是通过单独或组合任何基因区域的系统发育方法来实现，虽然使用系统发育理论的分类学可能并不总是有助于确定真菌的确切物种，但它肯定有助于将未知物种置于系统发育分支或组中，从而提供假定的物种鉴定。 要构建一个系统发育树，传统的邻接法（Neighbor-joining）和简约法（Parsimony）已经被更快的基于模型的方法所取代，如最大似然法（Maximum likelihood）和贝叶斯法（Bayesian inference）。最大似然方法的最优性准则是基于核苷酸或氨基酸序列进化的随机模型，找到似然评分最高的系统发育树。基于贝叶斯定理的贝叶斯法在2000年初被引入到分子系统发育中，贝叶斯法与最大似然法不同之处在于，后者寻求的是使树中给定的序列数据的概率最大化的树，而贝叶斯推断寻求的是给定序列进化数据和模型的树的概率最大化的树。  使用最大似然或贝叶斯法用于真菌物种鉴定的系统发育树的关键步骤图解 (图片来自此文献) 结 论 1 真菌的鉴定应尽可能结合微观形态、培养和分子特征。 2 ITS区域在大多数情况下工作良好，但应谨慎使用，特别是当仅使用GenBank BLAST进行真菌鉴定时。 3 首先对核糖体基因进行系统发育分析，因为公共数据库中有更多的数据可供比较。一旦能够缩小分类群或谱系的范围，或者如果核糖体基因不确定，则可以将其他基因序列与核糖体基因结合使用或单独用更精细的物种水平鉴定方法。 4 只有极少数真菌已经对ITS区域进行了测序，真菌是一个极其多样化的生物群体，因此没有一种万能药可以识别所有群体。  参考文献 Raja H A , Miller A N , Pearce C J ,et al. Fungal Identification Using Molecular Tools: A Primer for the Natural Products Research Community [J]. Journal of Natural Products, 2017, 80(3):756-770.DOI:10.1021/acs.jnatprod.6b01085. |
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