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Transcriptional linkage analysis with in vivo AAV-Perturb-seq 【研究模型/对象】小鼠（动物）和22q11.2缺失综合征 2023年9月20日，Nature期刊在线发表了一篇题为“Transcriptional linkage analysis with in vivo AAV-Perturb-seq”的研究论文，报道研究人员开发出的一种新的基因编辑技术模式：腺相关病毒（AAV）介导的直接体内单细胞CRISPR筛选方法，称为AAV-Perturb-seq。该方法可极大简化和加快基因功能的相关研究。 通过利用CRISPR-Cas技术，研究人员可以在单个动物的不同细胞中同时敲除不同的基因，确保每个细胞只改变一个基因，从而能够平行地观察组织中不同细胞不同基因功能。
实验模型：该实验模型主要研究与22q11.2缺失综合征相关的基因型-表型关系。该综合征是一种复杂的遗传疾病，影响多个器官，脑部首当其冲，与精神分裂症和自闭症谱系障碍有关。 相关背景：单细胞CRISPR筛选方法的问世为研究复杂的基因型-表型景观提供了高通量的方式。通过结合CRISPR文库、慢病毒递送和单细胞组学，这种方法已经应用于体外研究蛋白质错误折叠、基因调控和免疫等领域，以及体内研究小鼠神经发育。这些努力从根本上改变了我们理解细胞过程背后遗传网络的能力。 然而，目前的方法仅限于体外应用或仅适用于特定的发育时间点、组织和细胞类型，或者依赖于慢病毒感染。因此，迫切需要一个广泛适用的直接体内单细胞筛选的一般框架。这样的框架将使研究人员能够系统地探索疾病相关细胞和组织中的疾病相关风险等位基因的增长情况，了解它们的因果关系、功能和病理学，并开发新的诊断和治疗方法。这将为疾病研究和个性化医疗提供重要的突破。 实验方法和步骤：研究人员开发了全新的AAV-Perturb-seq技术，这是一种腺相关病毒介导的直接体内单细胞CRISPR筛选方法。科研人员收集大量测序数据后进行生信分析，他们选择了特异性的目标序列，确保gRNA序列与目标基因的DNA序列高度匹配，以降低非特异性剪切的可能性；然后评估剪切位点选择，选择目标基因中的关键位点进行编辑，例如编码区域的外显子或有功能影响的调控区域。避免选择在多个基因或多个外显子中存在的高度相似的剪切位点，以减少非特异性剪切的可能性；根据gRNA设计的原则，选择具有较高编辑效率和特异性的gRNA序列，对gRNA设计和优化。最后进行单细胞测序并分析。
实验步骤大概包括： 1. 创建AAV引导RNA（gRNA）文库。在该研究中，研究人员创建了一个AAV gRNA文库，并将重点放在位于22q11.2基因座内、在小鼠基因组中保守的基因上。通过这种方法，他们可以有针对性地研究这些基因在小鼠皮层中的表达情况和功能。为每个基因设计gRNA序列是一个关键步骤。gRNA序列通常与CRISPR-Cas9系统结合使用，以实现对基因的编辑或调控。这些序列应该能够准确地与目标基因序列配对，并在Cas9酶的辅助下引导特定的基因改变。 2. 体内感染方式。通过将含有gRNA的重组AAV注射到LSL-Cas9小鼠体内或对dCas9-KRAB小鼠进行转录抑制。 3. 采样测序和数据分析。研究人员在感染三周后收集大脑样本，发现成功地感染了大脑中的神经元和非神经元细胞，随后对从不同细胞中分离出的细胞进行聚类分析，可以帮助我们理解这些细胞在基因表达和功能上的差异。 聚类分析是一种常用的数据分析方法，用于将具有相似特征的对象分组为簇。在这个研究中，该分析被用来将从不同细胞中分离出的细胞按照它们的基因表达模式进行分类。这样可以识别出在基因表达上具有相似特征的细胞组群。 通过聚类分析，研究人员可能发现了一些神经元和非神经元细胞之间的表达差异，以及在感染后可能发生的基因调控效应。这些结果有助于我们深入了解这些细胞类型在22q11.2基因座中的基因功能，系统地研究与22q11.2缺失综合征相关的个体基因的基因型-表型景观，并且也可能对相关疾病的发病机制提供线索。
结果：通过AAV-Perturb-seq的应用，研究团队成功解剖了成年小鼠脑前额皮质中与22q11.2缺失综合征相关的基因的表型特征。研究鉴定了涉及已知和以前未描述的通路的三个基因，这些基因在体内协调神经元功能，并解释了在22q11.2缺失小鼠模型中观察到的约40%的转录变化。 该研究的结果表明，与22q11.2相关的基因DGCR8、DGCR14、GNB1L和UFD1L的扰动，可以解释在22q11.2缺失小鼠模型中观察到的约40%的转录变化。此外，研究人员发现DGCR14和GNB1L与22q11.2DS病理学相关，尽管这两个基因之前并不是科学界的关注焦点。这些结果表明，这些基因的扰动可能通过广泛改变与疾病易感性相关基因的表达，并通过一种涉及成熟神经元中RNA调节的机制，对22q11.2DS起作用。下一步，研究人员将确定在发育期间或之后恢复DGCR8、DGCR14、GNB1L和UFD1L的表达是否能够挽救22q11.2DS相关的神经元和认知表型。 结论：该研究的结果表明，在成熟神经元中发现的22q11.2缺失综合征转录表型可能部分是由于与疾病易感性相关的一类基因的广泛失调所致。这对RNA加工和突触功能的功能失调至关重要。此外，该研究还建立了AAV-Perturb-seq作为体内基因型-表型景观转录连锁分析和系统转录谱分析的强大方法。
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