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题 概述 粪便检查是临床上最常用的基础检查项目，一般病人均进行血、尿、便常规检查。由于目前的新的设备的增加，新的检测项目的开展，临床上很多医生对粪便检查不重视，从而忽略了粪便检查项目。随着临床上大量的抗生素不合理、超剂量、长期应用导致肠道菌群的改变，继发的肠道菌群紊乱，导致患者原有疾病的加重和增加的肠道疾患，使患者的健康很大的威胁，粪便染色镜检肠道细菌的技术是能够对肠道细菌进行观察和了解的直接方法，能够早期发现肠道细菌的变化，指导临床冶疗[1]。 粪便涂片诊断肠道菌群的理论和基础，其需要的设备简单,仅需一台显微镜、载玻片和革兰(Gram)染色液(Kopeloff 改良法,简称科氏Gram 法);操作方法简单;花费时间短(一般15min 即可得出结果);形象直观,直接了解类便菌群的“像”（“像”是指检验者通过对片的总数、兰阳性(G)与兰阴性(G-与球的比例以及细菌形态特征等观察的综合形象）,熟练者对诊断菌群失调有较高的准确性。涂片法也有其缺点，检验者必须有一定的经验，否则易判断错误;主要是定性检查,要求对菌群失调进行分度,初学者往往难以区分，致确定分度较困难。 为了克服上述缺点,检验者可以按本文介绍的方法,使操作标准化,并以本文介绍的菌群图片作对照,指导判断。并要亲自多做多看正常人与菌群失调病人的粪便涂片,经过一段时间就能掌握自如。对病人也要做定期随访性涂片检查。这样才能了解其菌群失调的动向。总的说来，粪便涂片能快速诊断菌群失调，为早期治疗提供线索[2]。 直接涂片法操作技术 (一)科氏改良法(Kopeloff modification)革兰染色液的配制[2] 1.结晶紫染液 A液:结晶紫025g研磨后,加入95%乙醇2ml,然后再加入蒸馏水 98ml; B液:碳酸钠1.25g,溶于蒸馏水 100ml中。 2.革兰碘液 氢氧化钠0.1g溶于蒸馏水2.5ml中,加碘2.0g 和碘化钾40g,再加蒸馏水至100ml,边加边搅拌,使之混合均匀,贮于棕色瓶中。 3.脱色液 丙酮30m1加入95%乙醇 70ml,混匀即可。 4.复染液 取沙黄2.5~3.0g加入95%乙醇 10ml,溶解后再加蒸水 100ml(或用 10%石炭酸复红液 10倍稀释即可)。 (二)涂片的制作[2] 将新鲜粪便直接涂抹在洁净的载玻片上,可按图 1所示方法制成推片可控制涂片的厚度和宽度。取推片在新鲜粪便上多处沾取标本直接涂抹在洁净的载玻片上，以 30°~40°角，以均匀速度推片，
图1 涂片制作方法 其粪膜厚薄如血膜为宜，面积约1~1.5cmx2cm 左右为宜(如图2 所示),自然干燥后在酒精灯火焰上通过 3次固定,制涂片 2张,1张作染色检查，另 1张备用。
图2 粪膜片 推片的制作方法有两种:@取厚盖玻片(如血细胞计数板盖玻片)折成 1/2 大小并用胶布将其固定于载玻片处制成推片，如图3 所示。@取载玻片用砂轮将两角斜向折断，并将头部磨光制成推片如图 4 所示，其特点简单易消毒。
图3 推片制作方法一
图4 推片制作方法二 推片消毒法:每次用过的推片需立即消毒备用，其方法是:用50ml容量广口瓶或玻片固定瓶3个，分别盛自来水(每日更新)、消毒剂(如速消净,需每日~每周更新)、和75%乙醇进行清洗和消毒，然后用干棉球擦干备用。 (三)粪便涂片检查注意事项[2] 1.粪便涂片快速查菌群，肉眼检查不能忽视。 (1)颜色:按实际情况以棕黄色、黄、绿红、灰色等词描述。 (2)性状:软便、硬便、稀水样便、粘液便脓性及脓血便、细条状便、柏油便、胨状便、食糜样或稀汁样便、黄绿色稀汁样便等若含有膜状物时应考虑假膜性肠炎，应补做艰难梭菌培养。 2.粪便标本务求新鲜，涂片厚薄适宜。 3.染色技术佳是诊断准确成功的关键,需革兰阳性或革兰阴性菌对比鲜明。 4.涂片的粪便不可稀释以防细菌变形。 5.遇粘液便、陈样便或水样便等尚可用牙签或滴注涂抹,均匀且不可过薄。 6.镜检时应将涂片视野全面观览，切不可看几个视野就计数或报告以防误差。 7.掌握各年龄组正常粪便菌群像，有助于对异常菌群像的正确诊断。 (四)染色步骤[2] 1.先将 A 液淹没标本,再加等量 B 液与 A液混合,1 分钟后倾去染液,细水冲洗; 2.加碘液，1~2min后细水冲洗; 3.再加脱色液脱色约半分钟; 4.然后用复染液染半分钟,细水冲洗,晾干或用吸水纸吸干即可其结果为革兰染色阳性菌染成紫色,阴性菌染成浅红色。 (五)显微镜油镜检查方法[2] 1.观察涂片和染色情况 一张合格的涂片应均匀,菌体不变形。良好的染色应将革兰阳性和阴性细菌着色反差好革兰阳性菌呈紫色，革兰阴性菌呈浅红色，且涂片上没有渣滓等。“涂片查菌群”就是通过油镜观察革兰染色的粪便涂片的菌群像一一通过观察细菌总数、形态特点、革兰阳性和革兰阴性细菌及杆菌和球菌比例,有无特殊形态的细菌增多等结果综合判断菌群状况。 2.总览细菌总数 观察菌群涂片时首先需总览细菌总数了解涂片上细菌的数量是增多还是减少,有无优势菌或真菌等。粪便中细菌的数量与肠道菌群处于平衡还是失调状态有着密切的关系，一般每油镜视野细菌总数在较高水平，且变化较大。准确计数是不切实际的也是无必要的。可通过“比例概数法”（一种“大概计数法”,可在览多个油镜视野的基础上,选择有代表性的较均的视野,选择局部可数的小区域,计数细菌的大概数量,然后扩大一倍区域,将细菌数相应增大一倍，以此类推很易计算出细菌的大概数量。由于细菌总数受涂片厚度及不同视野的影响,可信区间较大,该法有简便较准确的优点）进行判断。细菌总数过多的情况较少见或不易引起重视菌群失调时细菌总数多在正常、减少或消失。对于粪便细菌总数的评估,可参考表1进行。 表1 细菌总数评定标准
3.观察革兰阳性、阴性杆菌及球菌的比率改变 革兰阳性杆菌:革兰阴性杆菌:革兰阳性球菌:革兰阴性球菌比率(包含革兰阳性/革兰阴性和球菌/杆菌比)反映了粪便菌群的质素,它一般不受粪便稀释或浓缩的影响,所以较细菌总数有更大的意义，更能反映菌群的本质和预后。其大概比例可结合局部视野中菌群的各类细菌计数和检查者平时的经验判定。对于初学者,经常需要作一些计数工作，以积累经验。由于粪便细菌过多,选定有代表性视野中的部分区域作细菌分类计数，一般需要数 100~200个细菌，以求得其比例。对于初学者或为求得标准值时,可通过分割视野的方法:选取有代表性的视野,采用缩小视野方，可在目镜中加入一张带有 5个直径约0.2~0.3cm小孔的纸片，如图5所示，
图5 缩小视野用纸片 其优点是细菌在布满视野的上下左右均可以较全面计数到,较易计数，客观性强对该小视野中革兰阳性杆菌、革兰阴性杆菌和革兰阳性球菌、革兰阴性球菌等进行计数,换算出百分率。编者一般计数 1000 个细菌换算出百分率以求得各年龄组正常肠道菌群各类细菌的百分率(表4)。 表4 各年龄组细菌比率平均值的正常参考值(%)
革兰阳性杆菌、革兰阴性杆菌、革兰阳性球菌、革兰阴性球菌比率变化可分 5级(表2),报告方式见后文。 表2 各年龄组细菌比率平均值的正常参考值(%)
4.菌群失调分度诊断的标准 菌群失调分度的诊断标准见表 3。读者应根据年龄、饮食情况、粪便性状、病情表现、用药治疗情况等综合进行判断菌群失调的程度。涂片快速查菌群时,根据菌群的种类、数量和比例分三度(参见后文)。I度和II度菌群失调是数量改变,而III度是质的改变。 表3 菌群失调分度诊断的指标(参考标准)
注:应根据年龄、粪便性状、病情表现、用药治疗情况,综合进行判断菌群失调。快速涂片观察菌群数量和比例的改变程度,将菌群失调分三度。 5.涂片中所见的其它细菌或物体形态 在粪便涂片镜下常遇到奇形怪状、大小不一,粗细不等的菌体和细菌先端,形态为椭圆、尖形、方形等。这是初学者在实际工作中经常提出的问题,不知是什么菌,如何命名。将这些主要形态从镜下描绘出来,并冠以名称以供辨认。我们在粪便涂片所见到的这些形态与吕文胡克所描绘的各种微生物形态极为相似,可以肯定地说,并非致病菌，是细菌的多形态变化是细菌在环境发生改变时,如温度、pH 值、营养、药物免疫血清等作用下出现的形态变化,在不同的生命周期其大小可相差数倍,这种改变是暂时的,但在成年和老年人类便涂片较易见到。另外,粪便涂片行革兰染色,常见到少量结晶体,被石碳酸复红染为红色或暗红色,结晶形态为梭状,尖头弯曲常3个成束,这是脂酸和结合酸晶体,易被误认为梭菌,在粪便中有时可少量出现,增多时表示脂肪酸吸收障碍,如消化不良或肠道胆汁缺少(阳寨性黄)(参见图 159至图 162)
粪便直接涂片法的检查要点与报告要点[2] 肠道菌群失调反映在直接粪便涂片上,主要是细菌数量的增减与细菌种类及比例改变前者可以通过计数来估算，而后者的检测较复杂,这是因为粪便中细菌种类很多,主要的就有近百种,有的细菌形态有特征性,有鉴定意义,但是细菌的形态又可发生变异，也给鉴定带来困难。有些细菌的形态没有明显的特征,单依靠细菌的形态很难进行鉴定。为了对菌群失调的诊断有个基本的了解,可将直接粪便涂片观察到的细菌分为四类:即革兰阳性(G )杆菌、革兰阴性(G-)杆菌,革兰阳性(G )球菌、革兰阴性(G)球菌。通过标本中四类细菌的百分比、有无比例倒置与正常菌群平衡状态的正常百分比的比较,来评价受检者的菌群状态。
图6 粪便中菌体形态,菌体先端及菌体排列
图7 正常粪便常见的各种杆菌形态 1.短杆菌 2芽孢梭菌 3.粗螺菌 4.细螺菌 5.单杆菌 6.双杆菌 7.链杆菌 8.巨杆菌 另外,应尽可能具体写出增多或减少的细菌名称,要求实事求是，能写出的就写,难以写出的也不勉强，如上面已提到的,有些细菌特征性不明显,且形态容易变异,难以辨认。 (一)按细菌革兰染色特性及基本形态的细菌分类及其比例 在前面已提到肠道菌群鉴定中细菌种类很多，不可能单靠细菌的染色与形态来鉴定某种细菌及其数量，通过革兰阳性杆菌:革兰阴性杆菌:革兰阳性球菌:革兰阴性球菌比率能较好反映菌群的特征。由于不同年龄组人群菌群有较明显不同,该比率也有差别。我们对各年龄组正常人群共114 例。每例观察多个视野、计数 100 个细菌计算其革兰阳性杆菌、革兰阴性杆菌、革兰阳性球菌和革兰阴性球菌的百分率,以了解其肠道菌群状态。表 4 所示为通过114 例小样本调查得出的正常人各年龄组细菌比率的参考值(%),标本来源于南方医院婴儿室、幼儿园、学员队和干休所[4][5]。 表4 各年龄组细菌比率平均值的正常参考值(%)
(二)细菌种类的检测 要对肠道菌群进行形态学鉴定，就必须对粪便中的细菌种类有个系统的全面的了解(参见下述的“常见细菌的形态特点),对于可疑的致病菌(如霍乱弧菌、空肠弯曲菌、艰难梭状芽孢杆菌、白色念珠菌等)可增加相应的致病菌培养，以确定诊断和获得经验。 (三)常见细菌的形态特点 1.双歧杆菌属 革兰阳性无芽孢杆菌。有 28 个种,菌体长短不一,可有直、弯、分叉、棒状和匙形等多种形态。排列成单、双、短链、X、Y、V 或栅状。 2.优杆菌属(或称真杆菌属) 革兰阳性无芽孢杆菌,有 34 个种。有的种如迟缓优杆菌菌体较小,呈球杆状，排列成双或短链。有的种如粘性优杆菌,菌体较大,两端稍肿胀,排列成双或成小堆。 3. 乳杆菌属 革兰阳性无芽孢杆菌。44 种以上,多数乳杆菌菌体较大,直或微弯,两端圆。成双或短链排列。 4.拟杆菌属(或称类杆菌属) 革兰阴性无芽孢杆菌。原有 40 个种,目前,22 个种已划至普雷沃菌属(Prevotella)或其他菌属。现存 18 个种中有 10 个种归在脆弱类杆菌组,该组中脆弱类杆菌是无芽孢厌氧菌感染的主要病原菌。该组细菌形态呈多形性,菌体长短不一,两端圆而浓染,中间染色浅,似空泡,有时误认为是芽胞(但有芽胞细菌是革兰阳性菌，且菌体大)。 5.消化链球菌属 革兰阳性球菌。有 9 个种。不同种菌体形态不同,微小消化链球菌和厌氧消化链球菌的菌体小,排列成双或成链。大消化链球菌,菌体较大,排列成单、双、四联或小堆。 6.消化球菌属 革兰阳性球菌。原有 6 个种,目前5个种已划入消化链球菌,只存下黑色消化球菌一个种,菌体圆形,排列成双、短链或成堆。 7.梭杆菌属 革兰阴性杆菌。现有 15 个种,其中最常见的核梭杆菌的形态有特征性菌体细长(0.4~0.7umX3~10m)两端尖、中间膨大。菌体内有紫色颗粒，坏死梭杆菌的菌体成球杆状或长丝状,两端尖,呈多形性。 8. 梭状芽孢杆菌属 简称梭菌。革兰阳性有芽孢的粗大杆菌,注意勿与革兰阴性的无芽孢梭杆菌混淆。梭菌属有 83 个种。产气英膜梭菌的菌体短,有荚膜,芽胞呈椭圆形,次末端小于菌体。在体内不形成芽胞,在体外培养很少形成芽胞。艰难梭菌的菌体粗长,有些菌株成链状排列,芽胞卵圆形,末端大于菌体,使菌体呈球拍状。梭菌属中有些种在衰退时染色性可从革兰阳性转呈革兰阴性。 9.肠杆菌属 革兰阴性无芽孢杆菌，有 27 个属,如埃希菌属(代表种为大肠杆菌)志贺菊属、沙门菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属等。该科均为革兰阴性中等大小的杆菌,粪便直接涂片上不能区别属与种。 10.肠球菌属 革兰阳性球菌。肠球菌原属链球菌属的 D群链球菌,现另立为肠球菌属其中与人类有关的为类肠球菌、屎肠球菌。肠球菌的菌体圆形或椭圆形，成双或成链状排列。 11.葡萄球菌属 革兰阳性球菌。球形或略呈椭圆形,排列呈葡萄串状,但也可成双或短链状。 12.酵母菌 菌体圆形或卵圆形,形体较细菌大(2umX4um),革兰染色阳性,着色不均匀。以出芽繁殖,称芽生抱子 (四)粪便直接涂片查菌群报告方式 可通过粪便涂片中细菌总数、革兰阳性杆菌:革兰阴性杆菌:革兰阳性球菌:革兰阴性球菌比率、优势菌变化、可能的特征性细菌进行粪便菌群的报告。主要报告方式有二种:文字描述法和简表法。 1.文字描述法 就是具体描述细菌总数,革兰阳性杆菌、革兰阴性杆菌、革兰阳性球菌、革兰阴性球菌变化,有无优势菌,可能的特征性细菌,并考虑该年龄段菌群特点，提出肠道菌群的初步印象诊断。如: 文字描述法之一：肠道菌群基本正常:细菌总数在正常范围,革兰阳性杆菌多于革兰阴性杆菌,有少量的革兰阳性球菌和革兰阴性球菌,未见明显的酵母样菌。印象诊断:基本正常肠道菌群。 I度肠道菌群失调:细菌总数在正常低值,革兰阳性杆菌较正常菌减少,而革兰阴性杆菌稍有增加(或革兰阳性球菌较正常增加),呈I度比例失调改变。 II度肠道菌群失调:细菌总数较正常明显减少,革兰阳性杆菌显著减少,革兰阴性杆菌明显增多(拟杆菌、大肠杆菌),革兰阳性球菌较正常增多(双/链球菌、葡萄球菌等)(或球杆比例倒置),见到少量类酵母样菌,是II度菌群失调改变。 III度肠道菌群失调:细菌总数极少,革兰阳性、革兰阴性杆菌大部消失，类酵母样菌或葡萄球菌占优势(或出现革兰阳性粗大杆菌成堆排列，并有卵圆形芽孢，应考虑艰难梭菌)，呈III度菌群失调改变。 文字描述法之二:也可在空白化验单上盖印章,以求简便和规范,如表 5 所示。 表5 文字描述法之二
2.简表法报告菌群是先根据“涂片查菌群”所需观察的项目和正常参考值，刻成印章,印于空白化验单上,再根据涂片所见，填写即成,如表 6 所示。 表6 简表法报告菌群方法范例
也可以设计专用的报告单,如: 粪便涂片快速查菌群报告单
注:杆菌=革兰阳性杆菌十革兰阴性杆菌 球菌=革兰阳性球菌十革兰阴性球菌 总结 检测中应注意，粪便涂片后进行染色革兰氏染色技术是诊断准确成功的关键，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌要对比鲜明，否则导致不能够正确识别肠道细菌和种类，不能够正确的指导临床 。观察菌群涂片首先要总览细菌总数。了解涂片上细菌的数量是增多还是减少，有无优势菌或真菌。细菌总数过多的情况较少见或不易引起重视。菌群失调时细菌总数多在正常、减少或消失。 总之，通过对本组病例观察随着抗生素的应用时间的延长和抗生素应用种类的增多，发生肠道菌群紊乱的概率增加，通过进行粪便染色镜检肠道细菌检测可以对临床治疗和应用做到良好的指导，值得临床上高度重视粪便染色镜检对肠道细菌检测[3]。
参考文献： [1]刘江, 管红英. 保定市腹泻病人粪便涂片染色镜检结果分析[J]. 医学研究与教育, 2008, 025(002):51. [2]张秀荣. 肠道菌群粪便涂片检查图谱[M]. 2000. [3]王焕成.粪便染色镜检肠道细菌的临床应用分析[J].中外医疗,2010,29(27):57-57. [4]李兰娟. 感染微生态学[J]. , 2002. [5]孙雪荣.探析粪便涂片在诊断腹泻患儿肠道菌群失调中的临床意义[J].临床检验杂志：电子版,2018,7(2):285-285.  如果您认为本文有价值，还想看更多更及时的内容，记得点下“赞”和“在看”，再星标一下公众号 |
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