本文件描述了从人胃肠道上皮活组织及其上皮起源的病变活组织提取上皮细胞构建类器官的原理、 实验方法、传代、储存以及复苏方法。 本文件适用于科研用胃肠道上皮活组织及其上皮起源的病变活组织类器官的培养、类器官传代、类 器官储存和复苏。 
胃肠道上皮或上皮来源的病变活组织类器官 organoids of gastrointestinal epithelium and epithelial lesions 由正常胃肠道上皮组织或由上皮来源的病变组织中的上皮干细胞或者多能干细胞通过体外诱导分 化而来的，在细胞成分、组织架构及功能上与胃肠道正常上皮或者上皮来源病变组织具有相似性的3D 微小活组织结构。 胃肠道类器官培养基 culture medium of gastrointestinal organoid 可以实现体外模拟胃肠道上皮组织细胞生长所需微环境，能诱导胃肠道干细胞和多能干细胞分化为 各种类型的胃肠道上皮细胞，同时能够持续维持胃肠道干细胞和多能干细胞的特性，实现体外胃肠道活 组织类器官的长期存活的培养介质。 3D 培养基质胶 matrigel matrix 由层黏连蛋白、 IV 型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等组成，加入有生长因子和基质金属蛋白酶。 3D 培养基质胶在室温条件下能够聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜结构和功 能，能够为胃肠道黏膜上皮细胞的生长提供支架。 
传代 passage 将培养状态良好的类器官采用物理吹打和化学酶消化方法使其解离为单细胞悬液，再重新接种于与 原培养条件相同的培养体系内，继续进行类器官培养。新一代类器官与原来类器官具有相同的形态功能 特征。
冻存 cryopreservation 使暂时不需要进行实验研究的类器官脱离生长状态，但又可以保持其细胞组成、形态和功能特征的 低温冷冻过程。 复苏 recovery 将处于深低温冻存的类器官取出恢复其继续生长状态的过程。 
组织获取和类器官构建 
类器官的传代与冻存 
类器官的复苏 
废弃类器官处置 
质量控制 
附录A 胃肠上皮类器官培养用主要试剂材料与操作要点
1.主要试剂材料
3D 基质胶提取自基底膜的基质，主要由层黏连蛋白、 IV 型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等组 成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。基质胶在室温条件下聚合形成具有生物学活性的三维支架， 模拟体内细胞外基质的结构、组成、物理特性和功能。该结构不仅有利于体外细胞的培养和分化，而且 能够为胃肠道上皮细胞的生长提供支架。基质胶在零度以下低温环境呈液态，故凡是涉及基质胶的实验 操作皆应置冰盒操作。
胃肠上皮组织消化中涉及的消化酶主要有 IV 型 胶 原 酶 (callagenase IV) 与透明质酸酶 (hyaluronidase)。 其作用是水解结缔组织中的基质和胶原蛋白成分，从而使胃肠道上皮细胞从组织中 充分分离出来，以利于制备为单细胞悬液或细胞团。
类器官冻存液为无血清冻存液， 一般宜含有10%的二甲基亚砜(DMSO)。 2.类器官的构建流程
将组织块用不少于5ml 含有抗生素的 PBS 缓冲液浸泡，每隔5～10 min 在振荡器上振荡清洗一 次，弃污浊清洗液，加入前述清洗液继续振荡清洗，此步骤不少于4 次，总计时长不少于30min。
选用70～100 μm 的细胞过滤器进行过滤，去除组织液内的残渣。收集过滤液至15ml 无菌离心管，离心(200×g,5min) 组织细胞消化物，弃上清，保留沉淀物。
加入80 μl 的 Advanced DMEMF12 培养基重悬沉淀物。可依据沉淀物的量适当调整培养基的量。
将细胞重悬液与3D 培养基质胶按照1:1 混合。
吸取适量种板培养物(一般在80～100μl) 滴加至24 孔培养板中，根据种板培养物的量做2～3 复孔种板。然后将24 孔板置37℃培养箱孵育20～30min, 待基质胶充分凝固后向每孔加入类器官 培养基500～800μl。 3.胃肠上皮类器官培杨操作要点
胃肠上皮类器官培养过程中应定期观察、拍照。 一般在第2天于倒置显微镜下可以观察到类器官 小球，随着培养时间延长，类器官小球逐渐增多、增大。定期观察有利于及时发现污染。如果在培养3 天内出现基质胶浑浊，提示可能有真菌和细菌污染，应及时做丢弃处理。在类器官培养过程中也有可能 出现支原体污染。支原体在培养基上呈现团状、小球状生长，容易与类器官混淆，但支原体在显微镜下 观察不到上皮的组织细胞结构。若发现可疑支原体污染，可加入支原体去除剂进行挽救，支原体去除剂 可以抑制并消除支原体的生长，若仍不能去除支原体污染则做丢弃处理。
将获取的细胞悬液与3D 基质胶按照1:1 混匀吹打，吹打过程中切忌产生大量气泡，以免影响后 续培养物接种。24 孔板可提前于37℃培养箱预热30min, 以加速3D 基质胶的凝固。24 孔板在培 养物接种后可向周围多余空白孔内加入适量 PBS 缓冲液，以减少类器官培养基孵育过程中的液体挥发， 保持一定湿度。
胃肠上皮类器官可以连续传代超过10 代或持续培养6个月以上。与类器官有关的实验研究宜在 连续传代10 代以内或者持续培养6个月内进行。
冻存前将类器官吸至试管内，加入1ml 无动物源性重组胰蛋白酶，使其消化成单细胞悬液(1～2 h),200×g 离 心 5min。弃上清后加入适量类器官冻存液混匀(1ml 左右),分装于500 μl低温冻 存管中，放入程序性冻存盒内于-80℃深低温冰箱过夜保存，次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存。
从液氮罐中取出的类器官冻存管应快速放入37℃水溶锅中令其尽快融化。吸出类器官冻存物移至 1 5ml 无菌离心管中，再加入10 倍体积的 Advanced DMEM/F12 培养基混匀。之后操作同前述的类器官传代培养过程。
附录B 胃肠上皮类器官鉴定 1.类器官显微镜下状态评估
将类器官培养皿置于倒置显微镜下，在20倍视野下计数类器官数目。类器官数目不少于60个/ 视野表明类器官生长状态良好。生长活力好的类器官平均直径为160～200μl。若个别类器官体积过大 (可达1000μ)则提示类器官趋向衰老，应尽早传代，以防止衰老的类器官影响传代。 2.单细胞悬液细胞定量评估 在类器官传代前应用重组胰酶消化成单细胞悬液。可使用自动化细胞计数仪进行计数。将离心后的 细胞沉淀用 Advanced DMEM/F12 培养基重悬(约100μl), 经吹打混匀后吸取10μl 细胞悬液进行 细胞计数，以活细胞比例>90%表示制备的细胞活力良好。类器官单细胞悬液细胞数不宜低于1.5×105/ml。 3.细胞活力评估 在缺乏全自动细胞计数仪时，可采取台盼蓝(Trypan blue)染色进行活细胞计数。将离心后的细胞沉 淀用 Advanced DMEM/F12 培养基重悬(约100μl), 经吹打均匀后吸取18μl置于1.5 ml 的 EP 管， 向 EP 管中加入2 μl 中的0.4%的台盼蓝染液充分混匀，染色3 min, 取10 μl 细胞悬液加入血细 胞计数板，在倒置显微镜10×物镜下计数，分别计数四大格中未染成蓝色和染成蓝色的细胞总数。利 用如下公式计算每100 μl 体积中细胞总数和细胞存活率： 1）总数/100μl=[ (未染成蓝色细胞数+蓝色细胞数)4]× 10³× 1,11 2）细胞存活比例=未染成蓝色细胞数/(蓝色细胞数+未染成蓝色细胞数)× 100% 3）活细胞比率应>90%可用于类器官细胞培养。 4.类器官的形态学及免疫标记鉴定
胃黏膜上皮或者胃癌类器官成功构建后，通过制备冰冻切片或者石蜡包埋切片，进行苏木素/伊红 染色 (H&E) 进行形态学鉴定，通过免疫荧光或者免疫组化染色进行生物标志物检测，从而确定类器 官是否来自腺上皮细胞。正常胃上皮可以不同程度地表达 CDHI 、MUCSAC 、MUC6 、H'/K+ATPase、 PGC 和 GKNI; 胃腺癌可以不同程度地表达 CEA、CK19、CDH1、PCNA 和 Ki67。SMA 为肌源性标 志物，在胃上皮类器官与胃癌类器官不表达 SMA。
肠黏膜与肠癌类器官构建成功后，通过制备冰冻切片或者石蜡包埋切片，苏木素/伊红染色 (H&E) 进行形态学鉴定，通过免疫荧光或者免疫组化染色进行生物标志物检测。正常肠上皮可不同程度地表达 CK20、CDX1、MUC2、TFF3 和 CDHI; 肠腺癌可不同程度地表达 CEA、CDX2、CK20、PCNA 和 Ki67。 SMA 为肌源性指标作为内部参照，在肠上皮类器官与肠癌类器官不表达 SMA。
附录C 类器官的核酸与蛋白质提取 1 DNA 提取
2 RNA 提取
3 蛋白质提取
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