类器官crispr-cas9基因编辑及慢病毒转染实验方法

近几年，类器官研究十分火热，在信号通路机制，药筛药敏等研究中对类器官模型需求激增，其中利用crispr-cas9基因编辑技术对类器官进行敲低或敲减来造模是个不错的实验方法，今天小爱带大家来了解crispr-cas9基因编辑技术及慢病毒转染方法。

crispr基因编辑技术中有三个最为重要的组成部分：crRNA、sgRNA和Cas9蛋白。crRNA与Cas9蛋白形成复合物，sgRNA指引（crRNA/cas9）复合物靶向目的DNA区域定向切割DNA，从而达到基因编辑的目的。

图1 crispr-cas9基因编辑技术示意图

crispr-cas9基因编辑技术大体上有三种技术路线：All in one质粒转染法，病毒转化法，RNP复合物导入法。病毒转化法是将sgRNA、crRNA和表达cas9蛋白的序列整合进病毒中，再使用病毒感染细胞。相较于质粒转染法，优点在于sgRNA、crRNA和表达cas9蛋白可以持续存在于细胞中，从而达到一个很高的基因编辑效果。

图2 慢病毒转染细胞示意图

很多小伙伴对类器官转染方法十分好奇，类器官慢病毒转染和细胞转染大同小异，主要有以下几个问题需要注意：

1、类器官在进行慢病毒转染时需不需要从基质胶里解离出来？

考虑到病毒对于基质胶的穿透性及转染效率，转染时建议将类器官从基质胶中解离出来，用适当培养基重悬在孔板内进行。

2、类器官在进行慢病毒转染时需不需要消化成单个细胞？

类器官在进行慢病毒转染时，消化成单个细胞来转染效率比较高，建议消化成单个细胞进行感染。

3、类器官转染慢病毒多长时间合适？

转染时间可根据实际实验情况调整，通常是转染12-36小时，可以借鉴细胞转染时间。

4、类器官筛选时要不要消化成单个细胞？如果不需要消化，从胶里解离出来就行？还是在基质胶里就行？

类器官筛选不需要消化成单个细胞，在基质胶里就可以筛选，大部分的药物都可以穿透基质胶，作用到类器官上。

以下给大家整理了类器官转染步骤：

1）收集类器官并消化成单个细胞后，按2×105/孔铺到24孔板中（细胞密度可以自行摸索）；
2）用含有6μg/ml polybrene（polybrene的浓度可以自行摸索）的1ml新鲜类器官培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液，37℃孵育；
3）（对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤）4小时后加入1ml新鲜培养基以稀释polybrene；
4）继续培养12-36小时后，如有少量细胞贴壁，可用枪头轻柔吹打下来，混匀，将细胞培养基混悬液收集至离心管中（一般是6-8孔为一组）。300g 4℃ 富集离心5min后移去上清，添加1ml左右类器官传代培养缓冲液（abs9730）转移到1.5mlEP管，重新重悬离心；
5）观察收集到的组织体积，添加25倍组织体积的基质胶（abs9495）重悬混匀（金属冰盒或冰上操作）；
6）以24孔细胞培养板为例，每孔点胶25ul组织基质胶混合物进行铺板（金属冰盒或冰上操作），将铺好的培养板放入37℃培养箱中10-15min成胶，添加500-750μl 类器官培养基（恢复室温）进行培养；
7）待类器官出现明显增殖现象（一般需要2-3天），更换含有药物的类器官培养基进行筛选（如嘌呤霉素等），没有转染成功的类器官将会裂解凋亡，从而筛出成功转染的类器官；

（* 图源网络，仅供学习参考用）