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生物絮团系统富集的肠道菌群保护对虾免受副溶血弧菌侵染 Gut bacterial consortium enriched in a biofloc system protects shrimp against Vibrio parahaemolyticus infection  Article，2023-10-19，Microbiome，[IF 16.837] DOI：10.1186/s40168-023-01663-2 原文链接：https://microbiomejournal./articles/10.1186/s40168-023-01663-2 第一作者：Haipeng Guo（郭海朋）；Xuezhi Fu（符学志） 通讯作者：Haipeng Guo（郭海朋）；Deming Zhang（张德民） 主要单位：宁波大学 - 背景 - 凡纳滨对虾是世界三大对虾养殖品种之一，但病害频发导致它的产量和质量都不稳定，成为制约对虾养殖业发展的瓶颈。生物絮团养殖系统（Biofloc-based culture system，BFS）是基于在养殖系统中培育和调控微生物群落的观念上发展起来的一种新型的生态型水产养殖生产模式，具有净化养殖水质、提高对虾消化免疫和抗病力等优点。我们前期研究发现与换水养殖系统（Water-exchange culture system，WES）相比，BFS养殖提高了对虾养殖成活率，同时重塑了对虾肠道菌群组成，增加了肠道菌群的稳定性（Guo et al., npj Biofilms and Microbiomes, 2022）。但是这些重塑的肠道细菌菌群是否与其抗病性相关？具体哪些细菌类群与其相关，它们之间的因果关系与作用机制如何？这些问题还鲜有研究。本研究旨在阐明BFS养殖塑造的对虾肠道菌群与其抗弧菌侵染的因果关系及其潜在的作用机制，以期为对虾微生态病害防控技术及益生菌制剂的定向开发提供扎实的理论基础。 - 结果分析 - 1. 移植絮团虾粪菌赋予了对虾副溶血弧菌侵染抗性 BFS养殖对虾成活率和产量都显著高于WES，副溶血弧菌侵染后BFS虾开始出现死亡的时间显著晚于WES虾，成活率比WES虾显著提高30%以上，且BFS虾肠道中毒力基因拷贝数显著低于WES虾，表明BFS养殖增加了对虾抗弧菌侵染的能力。粪菌交互移植实验表明，无论是WES虾还是BFS虾，在移植来自WES虾肠道富集物（EnrichWES）后，均表现出对弧菌侵染的敏感性，而移植来自BFS虾肠道富集物（EnrichBFS）后，对弧菌侵染的抗性均显著增强，经过40 h侵染后仍有90%的存活率，且未表现出患病症状（图 1b和c）。  图1 WES和BFS对虾肠道富集液交互移植后对虾对副溶血弧菌侵染的抗性及表型特征 （a）实验示意图； （b）副溶血弧菌侵染后的存活曲线； （c）侵染后对虾的表型。 2. BFS虾具有更稳定和抗性的肠道细菌群落 BFS养殖提高了对虾肠道菌群的稳定性参数，如组内肠道菌群相似性（图3a）、负/正Cohesion比绝对值（图3b）和弧菌非侵染和侵染组菌群相似性（图3c）。相关性分析发现稳定性参数与对虾养殖存活率和侵染后存活率均呈正相关关系，尤其是与弧菌侵染后存活率呈极显著的正相关关系（图3d），进一步表明了BFS养殖可能通过提升对虾肠道细菌群落稳定性提高了对弧菌侵染的抗性。  图2 对虾肠道菌群稳定性参数及其与存活率的相关性 （a）WES和BFS对虾肠道细菌群落的组内相似性； （b）负/正Cohesion比的绝对值； （c）非弧菌侵染和侵染组对虾肠道菌群相似性； （d）细菌群落稳定性参数与养殖后和弧菌侵染后存活率的线性关系。 3. 移植BFS虾肠道菌群增加了对虾肠道菌群的稳定性和抗性 主坐标分析（PCOA）表明，粪菌交互移植后，对虾肠道细菌群落结构发生了显著变化（图 3a）。组内肠道菌群相似性结果发现，无论是WES虾还是BFS虾，在移植EnrichBFS后，其组内细菌群落相似性均显著增加（图 3b-d），表明移植BFS虾粪菌可以提升对虾肠道菌群的稳定性。移植EnrichBFS的WES和BFS虾均能显著增加肠道中红杆菌科（主要是副球菌属和鲁杰氏菌属）、黄杆菌科和微杆菌属的相对丰度，而降低弧菌的相对丰度（图 3e）。此外，WES + EnrichBFS与BFS + EnrichBFS非弧菌侵染组与弧菌侵染组之间的肠道细菌群落相似性显著高于移植EnrichWES的对虾（图 3f），且这些参数与弧菌侵染后的存活率呈显著的正相关关系（图 3g），表明移植BFS虾肠道菌群促进了对虾肠道菌群的稳定性和抗性，进而增强了对弧菌侵染的抗性。  图3 肠道菌群交互移植后对虾肠道细菌群落特征 （a）主坐标分析（PCoA）； （b）交互移植后虾肠道菌群的组内相似性； （c）WES + PBS和其他组的肠道菌群相似性； （d）BFS + PBS和其他组的肠道菌群相似性； （e）交互移植后的对虾肠道细菌群落组成； （f）非弧菌侵染与侵染组对虾肠道菌群相似性； （g）弧菌侵染后肠道菌群相似性与存活率的线性关系。 4. 添加絮团虾肠道菌群富集液增强了幼虾对弧菌侵染的抗性 将EnrichWES和EnrichBFS分别添加到幼虾养殖系统中进行弧菌侵染（图 4a）。养殖6天后，与对照和添加EnrichWES组相比，添加EnrichBFS显著提高了幼虾肠道饱满度、养殖后存活率和侵染后存活率（图 4b-e）。通过HE染色切片观察发现，对照组和EnrichWES组幼虾肝胰腺组织分泌细胞减少，EnrichBFS组幼虾肝胰腺分泌细胞连接紧密；弧菌侵染后，对照组和EnrichWES组分泌细胞破裂，肝胰腺基质受损严重，EnrichBFS组肝胰腺分泌细胞仍保持完整（图 4f）。添加EnrichBFS显著提升了幼虾肠道菌群的稳定性（图 4g-i），且稳定性参数与幼虾弧菌侵染存活率呈显著正相关关系（图 4j）。  图4 添加BFS虾肠道菌群富集液对幼虾表型、抗弧菌侵染能力及细菌组成的影响 （a）实验示意图； （b）肠道饱满度； （c）养殖后存活率； （d）养殖和弧菌侵染后幼虾的表型特征； （e）弧菌侵染后幼虾的存活率； （f）幼虾肝胰腺的组织切片； （g）肠道菌群组内相似性； （h）正/负Cohesion比的绝对值； （i）弧菌侵染前后的幼虾肠道菌群相似性； （j）肠道菌群稳定性参数与弧菌侵染后存活率的线性关系。 5. 合成菌群构建及其对副溶血弧菌侵染的抗性 以上微生物组学结果表明，属于副球菌属、鲁杰氏菌属、微杆菌属、黏着杆菌属和脱醌杆菌属的细菌类群在BFS虾肠道及其细菌富集液中均显著富集，为潜在的抗弧菌侵染的细菌类群。为了验证这些特异性类群与对虾抗弧菌侵染的因果关系，采用梯度稀释法对这些特异性的富集类群进行定向分离。最终，筛选出上述5个属中丰度最高OTU的代表性菌株，将这些菌株进行混合构建了一个合成菌群（SynComBFS）。将单一菌株和SynComBFS添加到幼虾养殖系统作为处理组，分别将未添加任何菌和添加EnrichBFS组作为阴性对照和阳性对照。养殖6天后发现，添加单一菌株均显著提高了幼虾的肠道饱满度、养殖存活率和对弧菌侵染的抗性（图 5a-c），但单一菌株的养殖存活率显著低于EnrichBFS组。为了验证这些菌株对提高对虾抗性是否具有协同效应，将五株菌株混合构建一个SynComBFS。养殖6天后，SynComBFS的添加相比任何单一菌株的添加都具有更好的肠道饱满度和存活率（图 5a和b）。与对照组相比，弧菌侵染后，SynComBFS的存活率显著提高，并且与EnrichBFS无显著差异（图 5c），表明由这5株菌组成的合成菌群对弧菌侵染抗性具有协同效应。  图5 单菌株和添加SynComBFS对养殖6天后的幼虾生长特性、抗弧菌侵染能力的影响 （a）肠道饱满度； （b）养殖后幼虾的存活率； （c）弧菌侵染后幼虾的存活率。 6. 合成菌群添加增加了养殖全程对虾的健康 为了验证SynComBFS在对虾养殖全程中的作用，分别设置了对照组和SynComBFS添加组进行了长期养殖实验。在养殖到第56天时，对照组对虾三个养殖桶中对虾均发病，平均存活率为29.5%，而SynComBFS添加组对虾存活率为86.7%（图 6a）。对照组对虾表现为典型的急性肝胰腺坏死综合征的症状（图 6b），而SynComBFS添加组对虾至养殖第80天时仍保持健康，且体长和体重都显著高于对照组（图 6c和d）。为了测定SynComBFS能否使患病对虾恢复健康，将对照组对虾分为CK、SynComBFS和EnrichBFS三组，结果表明，SynComBFS和EnrichBFS的添加能够有效的阻止对虾的死亡，并能使患病对虾恢复健康（图 6e和f）。添加SynComBFS组对虾的肠道菌群组内相似度最高，其次是对照组中的健康虾和患病虾（图 6i和h），表明添加SynComBFS显著改善了肠道菌群的稳定性。与对照组相比，在添加SynComBFS的组中共有66个显著富集OTUs，主要属于副球菌属、鲁杰氏菌属、微杆菌属和微小杆菌属（图 6j），表明SynComBFS中的细菌能很好的定植于对虾肠道中，进而促进了对虾的健康。  图6 长期养殖条件下添加SynComBFS对对虾生长特性、疾病恢复及肠道细菌群落的影响 （a-d）对照组和SynComBFS添加组中对虾（a）存活率、（b）表型特征、（c）体长和（d）体重（n = 20）； （e-g）SynComBFS和EnrichBFS添加组中对虾的存活率（e）、疾病恢复率（f）和表型特征（g）； （h）主坐标分析（PCoA）； （i）肠道菌群的组内相似性； （j）细菌群落组成。 - 结论 - 本研究利用粪菌移植和合成菌群深入揭示了生物絮团养殖的对虾抗弧菌病的微生态学机制（图7）。主要结论为：移植絮团虾粪菌显著提升了对虾的抗弧菌侵染能力，同时显著增加了对虾肠道菌群的稳定性，菌群稳定性参数与弧菌侵染后成活率显著相关；絮团虾肠道显著富集了诸如鲁杰氏菌、副球菌、微杆菌等属类群，通过定向分离这些富集类群的对应菌株，构建了由5株细菌组成的合成菌群；合成菌群添加后能很好的定植在对虾肠道中，增强肠道细菌群落的稳定性，并能显著提升对虾的消化、免疫和抗病性能。本研究证实了肠道土著菌群在保护对虾免受病原菌侵害方面的重要作用，为开发防控水生动物病害的益生菌提供了坚实的基础。  图7 生物絮团养殖的对虾抗弧菌侵染的微生态学机制 宁波大学张德民/郭海朋对虾养殖微生态组是国内外最早聚焦于对虾养殖系统微生物群落的演替、构建过程和土著益生微生物资源开发的研究团队之一。近几年，该小组深入研究了外源碳源输入对对虾养殖系统细菌群落调控的影响，阐明了碳源输入对凡纳滨对虾肠道细菌群落的影响及其调控机制（Guo et al., npj Biofilms and Microbiomes, 2022; Huang et al., Marine Life Science & Technology, 2022, 4: 222-236; Dong 等, Aquaculture, 2023）；揭示了生物絮团不同粒级细菌群落差异及其对对虾肠道菌群的塑造作用（Huang et al., Aquaculture, 2020）；揭示了蔗糖输入下对虾肠道菌群和活性代谢产物的互作关系（Guo et al., Frontiers in Microbiology, 2020）；解析了蔗糖输入对水体细菌群落结构和组成的影响及其与水质参数的相关性（Zhu et al., Aquaculture Research, 2021）。同时也深入解明了对虾病害发生的微生物生态学机制及其健康微生物群落特征（Fu et al., Aquaculture, 2024; Wang et al., Aquaculture, 2022; Dong et al., Aquaculture, 2021）。这些结果为发展对虾微生态干预技术及微生物制剂的定向开发提供了扎实的理论基础。 参考文献 1.Haipeng Guo*, Xuezhi Fu, Jikun He, Ruoyu Wang, Mengchen Yan, Jing Wang, Pengsheng Dong, Lei Huang, Demin Zhang*. Gut bacterial consortium enriched in a biofloc system protects shrimp against Vibrio parahaemolyticus infection. Microbiome, 2023, 11:230. 2.Xuezhi Fu, Jikun He, Jing Wang, Fengguang Shen, Jiayi Qiu, Chen Chen*, Demin Zhang, Haipeng Guo*. Specific gut bacterial taxa inhabited in healthy shrimp (Penaeus vannamei) confer protection against Vibrio parahaemolyticus challenge. Aquaculture, 2024, 579, 740192. 3.Pengsheng Dong, Haipeng Guo*, Lei Huang, Demin Zhang, Kai Wang*. Glucose addition improves the culture performance of Pacific white shrimp by regulating the assembly of Rhodobacteraceae taxa in gut bacterial community. Aquaculture, 2023, 567: 739254. 4.Haipeng Guo*, Pengsheng Dong, Fan Gao, et al. Sucrose addition directionally enhances bacterial community convergence and network stability of the shrimp culture system. npj Biofilms Microbiomes, 2022, 8: 22. 5.Lei Huang, Haipeng Guo*, Zidan Liu, et al. Contrasting patterns of bacterial communities in rearing water and gut of Litopenaeus vannamei in response to exogenous glucose addition. Marine Life Science & Technology, 2022, 4: 222-236. 6.Ruoyu Wang, Heping Chen*, Yueyue Zhu, Zaher A. Al-Masqari, Mengchen Yan, Gengshen Wang, Pengsheng Dong, Fan Gao, Tongxia Lu, Demin Zhang, Haipeng Guo*. Survival status of Penaeus vannamei is associated with the homeostasis and assembly process of the intestinal bacterial community. Aquaculture, 2022, 558: 738398. 7.Pengsheng Dong, Haipeng Guo*, Yanting Wang, Ruoyu Wang, Heping Chen, Yueji Zhao, Kai Wang, Demin Zhang*. Gastrointestinal microbiota imbalance is triggered by the enrichment of Vibrio in subadult Litopenaeus vannamei with acute hepatopancreatic necrosis disease. Aquaculture, 2021, 533:736199. 8.Yueyue Zhu, Sipeng Wang, Lei Huang, et al. Effects of sucrose addition on water quality and bacterioplankton community in the Pacific White Shrimp (Litopenaeus vannamei) culture system. Aquaculture Research, 2021, 52: 4184-4197. 9.Haipeng Guo*, Lei Huang, Songtao Hu, et al. Effects of carbon/nitrogen ratio on growth, intestinal microbiota and metabolome of shrimp (Litopenaeus vannamei). Frontiers in Microbiology, 2020, 11: 652. 10.Lei Huang, Haipeng Guo*, Chen Chen, et al. The bacteria from large-sized bioflocs are more associated with the shrimp gut microbiota in culture system. Aquaculture, 2020, 523: 735159. - 作者简介 - 第一作者 宁波大学 海洋学院 郭海朋（共通讯） 博士、副教授 农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室学术骨干。2017年12月毕业于浙江大学，获理学博士学位，2015年12月至2017年10月获国家留学基金委资助至加拿大Lakehead University（湖首大学）生物工程系学习。主要从事对虾肠道微生物生态和土著微生物资源的开发利用等研究。主持国家自然科学基金等项目6项，参与各类项目10余项。在Microbiome，Bioresource Technology，npj Biofilms and Microbiomes，Biotechnology for Biofuels，Microbioal Biotechnology，Aquaculture等国际主流SCI刊物上发表学术论文50余篇；申请和授权发明专利10项，其中2项转让到企业；获宁波市优秀论文三等奖和优秀奖各1项。 宁波大学 海洋学院 符学志 硕士研究生 主要从事水产动物养殖及土著微生物菌剂开发应用等工作，在Microbiome，Renewable Energy，Aquaculture等国际主流SCI刊物上发表学术论文4篇；申请发明专利5项。 通讯作者 宁波大学海洋学院 张德民 二级教授、博士生导师 张德民，是“863”项目首席专家、农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室“微生物与水域生态健康”团队负责人、中国微生物生态学副主任等。主要从事对虾养殖系统微生物组及其调控技术研究。主持完成国家863项目、国家自然基金面上项目等10余项，在Microbiome，npj Biofilms and Microbiomes，Molecular Ecology，Environmental Microbiology，Applied and Environmental Microbiology，Aquaculture等杂志上发表SCI收录论文70余篇，授权国家发明专利10余项。 |
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