Cancer Communications | 在表达PDGF- B的实体瘤中，血管周围的周细胞会产生红细胞

新用户70744803 2023-10-23 发布于重庆

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大家好，今天跟大家介绍一篇发表于Cancer Communications上的论文Perivascular localized cells commit erythropoiesis in PDGF-B-expressing solid tumors。文章的第一作者是来自卡罗林斯卡医学院微生物、肿瘤和细胞生物学系的Kayoko Hosaka，通讯作者是来自卡罗林斯卡医学院的Yihai Cao教授、Masahito Yoshihara教授以及复旦大学的杨云龙教授。

肿瘤具有不断生长的特点，其生长过程需要红细胞提供大量的氧气。虽然在成年哺乳动物中，骨髓（BM）是调节造血功能的主要器官，但是在一些病理生理环境中也可以发生髓外造血。然而，肿瘤是否能促进造血并未被报道。研究表明实体瘤中含有高密度的由内皮细胞和血管周细胞生成的微血管。其中，周细胞在肿瘤微环境（TME）中仍然保留祖细胞特性，可以分化成其他细胞。且在生理条件下，内皮细胞产生的血小板生长因子B（PDGF-B）可以将周细胞募集到微血管表面并调节其定向分布以形成成熟血管。基于此，作者探究了在病理条件下，在富含PDGF-B的肿瘤环境（TME）中，微血管周围的周细胞是否以及如何参与造血。

PDGF-B 驱动周细胞向红细胞谱系分化

首先，作者从小鼠的肺组织中分离了表达神经元-神经胶质抗原-2（NG2）的原代周细胞，用于探究血管周细胞的干细胞性能。PDFG-B是PDGF家族的一员，可以激活PDGF受体PDGFRα和PDGFRβ。NG2周细胞表达PDGFRs并PDGF-B做出响应。如图1A所示，作者用PDGF-B刺激原代NG2周细胞，并对其全基因表达谱进行了分析。结果发现，PDGF-B刺激的NG2周细胞的基因表达谱具有神经元干细胞、上皮基底层干细胞、间充质祖细胞、胚胎心内膜细胞、成纤维细胞和BM红系细胞等干/祖细胞的特征。通过分析NG2周细胞和造血干细胞（HSPC）的全基因组相关性发现，PDGF-B刺激下的NG2周细胞属于红系谱系中的细胞类型（图1B-C）。为了进一步确定这些细胞的身份，作者对造血相关基因数据进行了详细分析，结果表明在PDGF-B刺激下的NG2周细胞与造血祖细胞（HPC）的基因谱相近（图1D）。

由于间质成纤维细胞也表达PDGFRs并对PDGF-B刺激有反应，作者使用BM来源的间质成纤维细胞S17作为对照，来确定PDGF-B刺激后的NG2周细胞是否属于造血祖细胞。通过Gene Ontology（GO）分析发现，PDGF-B刺激的NG2周细胞富含造血相关基因，而BM来源的间质成纤维细胞则相反（图1E-F）。此外，相对于S17，PDGF-B刺激后的NG2周细胞的上调基因与BM具有较高的相似性（图1G）。以上结果表明，PDGF-B驱动NG2周细胞向造血谱系分化。

PDGF-B诱导肿瘤基质中促红细胞生成素（EPO）的产生

在生理条件下，肾脏产生的EPO是髓系祖细胞转变成红细胞所必需的一种细胞因子，它通过与红母细胞祖细胞中表达的EPO受体(EpoR)结合来调节红细胞生成。作者前期的研究表明，肿瘤来源的PDGF-B也可以诱导基质成纤维细胞表达EPO。因此，作者用过表达PDGF-B的Lewis肺癌(LLC)和纤维肉瘤(T141)细胞建立的同基因肿瘤小鼠模型，研究了PDGF-B是否能够在癌症相关成纤维细胞（CAF）中诱导EPO产生。通过对肿瘤组织中Epo mRNA和EPO相关蛋白的定量分析表明，相对于载体肿瘤，PDGF-B-LLC肿瘤中的Epo mRNA增加了约7倍（图1H），EPO也有所增加（图1I），表明PDGF-B确实可以诱导肿瘤组织产生EPO。有趣的是，通过对PDGFRα和PDGFRβ以及EPO的成像发现，EPO与这两种在CAF中表达的受体蛋白的分布位置一致（图1J）。为了进一步验证这一发现，作者对肿瘤中可以表达PDGFR的细胞进行分离和分析，发现CD31内皮细胞、NG2周细胞、F4/80巨噬细胞是肿瘤组织中EPO的来源（图1K）。在人类癌细胞系A431的实验的结果（图1L-M）也证明了PDGF-B可以诱导肿瘤组织产生EPO。

图1：基质细胞中EPO的基因表达谱和表达水平的升高。（A）PDGF-B刺激NG2周细胞（PC）基因表达分析的实验设计示意图。（B）PDGF-B刺激NG2PC对BM中细胞类型的特异性基因集的富集分数。展示的为富集分数最高的八种细胞类型。（C）PDGF-B刺激NG2 PC生成造血细胞类型的预测雷达图。（D）经过PDGF-B刺激后，其造血相关基因明显上调。（E）PDGF-B刺激的PCs和S17成纤维细胞中造血相关基因表达的热图。（F）PDGF-B刺激的PC和S17中造血相关基因的对数差异表达基因分析（logFC）。（G）PDGF-B刺激的PC和S17成纤维细胞的BM相关基因表达谱。LLC肿瘤和T141肿瘤组织中Epo mRNA的qPCR分析（H），EPO蛋白水平的ELISA分析（I）。（J）用抗体标记肿瘤组织中PDGFRα（绿色），PDGFRβ（绿色）和EPO（红色）的代表性图像。（K）从肿瘤组织中分离的原代PDGFRα和PDGFRβ群体的Epo mRNA水平的qPCR分析。（L）shCont /shPDGFB A431 肿瘤中Epo mRNA和EPO mRNA的qPCR分析以及小鼠EPO蛋白含量分析。（M）肿瘤组织中PDGFRα（绿色），PDGFRβ（绿色）和EPO（红色）的代表性图像及双阳性信号的定量分析。

肿瘤组织中NG2周细胞的定位及其分化追踪

随后，作者培养了可以产生红色荧光（NG2-CreERT2:R26R-tdTomato）的小鼠周细胞，用于追踪肿瘤周细胞的分化，并在纤维肉瘤细胞系中证明了该方法的可靠性。此外，作者还证明tdTomato红色标记的周细胞仍具有干细胞和祖细胞特征。鉴于tdTomato标记的周细胞保留了干细胞和祖细胞特征，且能够在PDGF-B诱导下产生EPO，作者探讨了PDGF-B驱动周细胞向红系分化的可能性。通过红细胞标记物Ter119、转铁蛋白受体（CD71）与tdTomato标记周细胞共染色，利用流式细胞仪（FACS）证明PDGF-B促进周细胞向红系细胞分化。

单细胞测序分析与巨核细胞-红系祖细胞密切相关的周细胞亚群

为了进一步探究PDGF-B诱导下的周细胞分化异质性，作者对其中的513个细胞进行了单细胞转录组测序(RNA-seq)，如图2所示。图2B-C表明，这些细胞可以分为五个亚群。通过对这些集群的GO分析发现，每个亚群都有属于自己的高表达基因。随后，通过卡方实验证明PDGF诱导下的周细胞组中，PC1 和 PC3 增加，而PC4 和 PC5 下降。通过对每个周细胞亚群中巨核细胞-红系祖细胞(MEPs)的红系偏倚研究发现，周细胞的PC3簇在转录上接近MEP，且其高表达基因也在MEP中特异性表达（图2D-G）。以上结果表明，在PDGF-B刺激下的NG2周细胞具有转录异质性，且更偏向于分化为红系细胞。

图2. 通过单细胞RNA测序对周细胞亚群进行分类并分析其与造血祖细胞的关联。（A）分离L⁻-S-NG2PC细胞用于单细胞RNA测序的实验流程图。（B）由细胞簇(左图)和样本组(右图)着色的周细胞的UMAP聚类图。（C）左边为每个细胞集群的前100个标记基因热图，右边的为每簇标记基因中表达最多的三个基因。（D）柱形图为载体和PDGF刺激组观察到的五个细胞簇的比例。（E）层次聚类(hierarchical clustering)分析证明了MEP和周细胞簇之间的转录相似性。（F）箱形图显示了MEP与每个周细胞簇中单个细胞之间的相关性。（G）小提琴图表示四种MEP特异性基因在MEP和五个周细胞亚簇中的表达。

随后，作者用专为BM和红系细胞集落形成而设计的M3434培养基对从肿瘤组织中分离的Lin⁻/Sca1/NG2周细胞进行培养。通过荧光显微镜和FACS对细胞集落中荧光标记的特异性标志物进行分析，发现随着分化的进行，周细胞标志物，包括Pdgfra，Pdgfrb和Cspg4等下调，而红细胞标志物，如血红蛋白、Ter119等上调。以上结果表明，Lin⁻/Sca1/NG2周细胞在PDGF-B的作用下形成红细胞样集落。为了进一步探索该过程的分子机制，作者在红细胞集落形成过程中进行了PDGF和EPO功能的获得和丧失实验（gain-and loss-of-function approaches）。实验结果表明，PDGFRβ信号传导和EPO在调节周细胞向红系分化过程中起着重要作用。这一结果也在人类头颈部鳞状细胞癌（HNSC）和嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PCPG）的实验中得到了验证。在工作的最后，作者进一步证明了肿瘤组织中红系细胞集落的形成来自于周细胞的分化而非BM衍生的细胞。