一、 细胞培养基 杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM(Dulberco Modified Eagles Mediμm)两种基础培养基,具体配制方法按厂家规定的程序,配好后过滤除菌(0.22μm),分装,4℃保存。 (1)不完全RPMI-1640培养基:RPMI-1640培养基原液96mL 100×L.G.溶液1mL 双抗溶液1mL 7.5% NaHCO3溶液1-2mL HEPES溶液1mL (2)不完全DMEM培养基:DMEM 13.37g 超纯水或四蒸水980mL NaHCO3 3.7g 双抗溶液10mL 100×L.G.溶液10mL 用1mol/L HCl调试PH至7.2-7.4,过滤除菌,分装4℃保存。 (3)完全RPMI-1640或DMEM培养基: 不完全RPMI-1640或DMEM培养基80mL 小牛血清15-20mL 用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后的杂交瘤细胞培养。 (4)HT培养基:完全RPMI-1640或DMEM培养基99mL HT贮存液1mL (5)HAT培养基:完全RPMI-1640或DMEM培养基98mL HT贮存液1mL A贮存液1mL 二、 氨基喋呤(A)贮存液(100×,4×10-5mol/L) : 称取1.76mg氨基喋呤(Aminopterin MW 440.4),溶于90mL超纯水或四蒸水中,滴加1mol/L NaOH 0.5mL中和,再补加超纯水或四蒸水至100mL。过滤除菌,分装小瓶(2mL/瓶),-20℃保存。 三、 次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)贮存液(100×,H:10-2mol/L,T:1.6×10-3mol/L): 称取136.1mg次黄嘌呤(Hypoxanthine,MW 136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2),加超纯水或四蒸水至100mL,置45-50℃水浴中使完全溶解,过滤除菌,分装小瓶(2mL/瓶),-20℃冻存。用前可置37℃加温助溶。 四、 L-谷氨酰胺(L.G.)溶液(100×,0.2mol/L) : 称取2.92g L-谷氨酰胺(L-glutamine,MW 146.15),用100mL不完全培养液或超纯水(或四蒸水)溶解,过滤除菌,分装小瓶(4-5mL/瓶),-20℃冻存。 五、 青、链霉素(双抗)溶液(100×): 取青霉素G(钠盐)100万单位和链霉素(硫酸盐)1g,溶于100mL灭菌超纯水或四蒸水中,分装小瓶(4-5mL/瓶),-20℃冻存。 六、 7.5% NaHCO3溶液 : 称取分析纯NaHCO3 7.5g,溶于100mL超纯水或四蒸水中,过滤除菌,分装小瓶(4-5mL/瓶),盖紧瓶塞,4℃保存。 七、HEPES溶液(1mol/L): 称取23.83g HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N,-2-ethanesulfonic acid,N-2-羟乙基哌嗪- N,-2-乙基磺酸,MW 238.3)溶于100mL超纯水或四蒸水中,过滤除菌,分装小瓶(4-5mL/瓶),4℃保存。 八、 8-氮鸟嘌呤贮存液(100×): 称取200mg 8-氮鸟嘌呤(8-azaguanine,MW 152.1),加入4mol/L NaOH 1mL,待其溶解后,加入超纯水或四蒸水99mL,过滤除菌;分装小瓶,-20℃冻存。使用时按1%浓度加入到培养液中(即终浓度为20μg/mL)。 九、 50% PEG: 称取PEG 1000 或4000 20-50g于三角瓶中,盖紧,60-80℃水浴融化,0.6mL分装于青霉素小瓶中,高压蒸汽20分钟灭菌,-20℃存放备用。临用前加热融化,加等量不完全培养基,用少许7.5% NaHCO3调PH至8.0,或购买Sigma或Gibco公司现成产品。 十、0.1 M NaOH: 0.4 g NaOH 溶于100 mL水,过滤除菌 十一、1 M HCl: 10 mL 浓盐酸 加110 mL水,过滤除菌
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