转：慢病毒载体包装

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2010-10-22 19:11:09 来源:未知 【大 中 小】 评论: 条

摘要： 现在使用的慢病毒载体大多是四质粒系统，即是Gag/Pol、Rev、VSV-G（代替HIV-1的Env）分别独立放置在3个质粒上（pGag /Pol、pRev、pVSV-G），另外的一个就是可以放目的基因的质粒（包含有LTR sequence）。VSV-G来源于水泡口炎病毒具有广泛的嗜性，能够感染大多

 

现在使用的慢病毒载体大多是四质粒系统，即是Gag/Pol、Rev、VSV-G（代替HIV-1的Env）分别独 立放置在3个质粒上（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），另外的一个就是可以放目的基因的质粒（包含有LTR sequence）。VSV-G来源于水泡口炎病毒具有广泛的嗜性，能够感染大多数细胞。四质粒系统将Gag/Pol、Rev分别放在不同的载体上，增强 了病毒载体的安全性。因为慢病毒系统能够感染non-dividing human cell，所以在基因治疗方面应用很广，但是它的缺陷就是会整合到细胞基因组中，可能引起细胞癌变（由于插入抑癌基因中）。现在慢病毒载体的包装主要采用 四质粒共转染293细胞，包装滴度一般不是很高10E8左右，我包装的结果10cm dish只能达到10E7左右，更高需要进一步优化细胞状态、转染效率、质粒比例。

 

 

我用磷酸钙转染，转染效率还是很高的能达到90%以上。用磷酸钙转染的化，主要2×HeBs配制的时候PH要求高， 一般设置几个PH梯度（可以6.9、6.95、7.00、7.05、7.10、7.15）。配制好后就可以转染带GFP的载体，通过观察荧光就可以判定那 个PH值适合实验室的情况。2×HeBs标准操作上是要求7.05，但是由于实验室水还有PH计的影响，所以不一定你配制7.05的PH值能够获得很高的 转染效率。

配方：

2.5M 氯化钙

2×HeBs buffer(0.28M NaCl, 0.05M HEPES, 1.5mM Na₂HPO₄, 用5 N NaOH调节pH到7.05)

Lentivirus packaging protocol：

4种质粒的共转染293T细胞（预实验）

（1）质粒的混合（转染24孔板）将4种质粒混合于1.5 ml灭菌管中，加Special H₂O至总体积为50μl，混合比例如下：

	V8	Gag	Pack2	Pack3
质粒总量（ug)	11.25	7.3	3.9	2.8

（2）加15μl 2.5M CaCl₂到载体的混合体系中，并加水补足150μl 。

（3）在装有150μl 2×HeBs的管中逐滴加入CaCl₂与DNA的混合溶液(此过程要求在一分钟内完成)，加入的同时在振荡器上振荡或用移液器吹打溶液。

（4）混合物于室温下静置时间设为10min

（5）将混合物（100μl）分散逐滴加入每个孔中。

（6）放入培养箱过夜培养，培养条件37℃ 3%CO₂。

（7）观察细胞。此时细胞应该长成单层，并在荧光显微镜下观察转染效率，转染效率应该在90%以上。

（8）更换培养基，加入10ml DMEM+2%NBS 培养基37℃ 10%CO₂ 培养过夜。

（9）48小时后收取病毒（只收集第一轮培养基上清）。

（10）将收取的病毒液稀释100赔后感染293T细胞。

（11）培养两天后，观察细胞荧光数目。

 

5、大量包装慢病毒及滴度确定

（1）质粒的混合（以转染10 cm培养皿为例）

将4种质粒混合于15 ml灭菌管中，加Special H₂O至总体积为500 μl，混合比例根据上面实验结果得出。

（2）加50μl CaCl₂至上述15 ml灭菌管中,并加水补足500μl。

（3）在装有500μl 2×HeBs的管中逐滴加入CaCl₂与DNA的混合溶液(此过程要求在一分钟内完成)，加入的同时在振荡器上振荡或用移液器吹打溶液。

（4）混合物于室温下静置时间根据上面实验结果得出。

（5）将混合物（1 ml）分散逐滴加入培养皿中（10 cm皿中10 ml细胞培养基）。

（6）放入培养箱过夜培养，培养条件37℃ 3%CO₂。

（7）观察细胞。此时细胞应该长成单层，并在荧光显微镜下观察转染效率，转染效率应该在90%以上。

（8）更换培养基，加入10ml DMEM+2%NBS 培养基37℃ 10%CO₂ 培养过夜。

 

5.1、收集第一轮的培养基上清

（1）转染后的细胞CO₂培养箱48 h，37℃，收集上清。

（2）收集的上清，4℃ 8000g离心10 min，除去细胞碎片，0.45 μm PVDF膜过滤。

（3）所得病毒液一部分用于测定病毒滴度，其余可冻存于-80℃。

（4）加入10ml新鲜的DMEM+2%NBS培养基。

 

5.2、收集第二轮的培养基上清

（1）加入新鲜培养基后，培养24小时。

（2）收集的上清，4℃ 8000g离心10 min，除去细胞碎片，0.45 μm PVDF膜过滤。

（3）所得病毒液一部分用于测定病毒滴度，其余可冻存于-80℃。