利用同源重组的方法构建LentiCRISPRv2-GOI过表达载体,采用双酶切的方式获得线性化载体,根据同源重组设计目的片段的引物。目的片段的获得分为两步PCR方法,第一步从模板中扩增出目的片段的ORF,第二步扩增加入Gsg-3×FLAG序列。采用one step cloning试剂盒连接目的片段与线性化载体,利用Amp进行抗性筛选。 图1 基因序列第一轮扩增 3、双酶切pLentiCRISPRv2载体 4、目的基因与线性化载体连接 利用ClonExpress II one step coloning Kit连接目的片段和线性化载体。每个实验组各挑取单克隆菌落,于LB/ Amp培养基中扩增,并送样测序。 5、LentiCRISPRv2-GOI无内毒素质粒提取 病毒包装 1、培养细胞,配制PEI-Opti-MEM和质粒混合液,将PEI-Opti-MEM加入各质粒混合液中,轻弹管壁混匀,室温静置孵育15~20 min。 2、将上混合液小心滴加到培养基中,轻轻晃动摇匀,在培养箱中继续培养18 h。 3、18 h后小心吸去培养基,加入5 mL新配制的完全培养基。 4、42 h后收集培养上清,离心,0.45µm滤膜过滤,液氮速冻,-80℃保存。 细胞转染 1、配制梯度病毒稀释液 2、在六孔板中加入病毒稀释液,随后立即加入细胞,摇匀,以下每孔依次按此操作进行。细胞于培养箱中静置培养48 h。 阳性单克隆细胞株筛选 1、细胞转染48 h后,更换完全培养基,随后1~2 d更换一次。 2、筛选7天后,对照组细胞全部死亡,实验组细胞扩大培养,同时进行单克隆细胞筛选。 3、96孔板每孔加100 μL细胞悬液,用封口胶将孔板封好,放于培养箱中培养 静置培养48 h后,更换完全培养基,随后1~2 d更换一次,每日观察并记录单克隆形成情况。 7天后挑选阳性单克隆进行扩增,并取样验证——Western blot 图3 阳性单克隆细胞株基因表达验证——Western blot 基因测序验证 提取单克隆细胞株基因组DNA,测序验证基因稳定转染单克隆细胞株的基因序列的准确性。 |
|
来自: 生物学渣 > 《细胞株/细胞系/干扰/过表达》