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近年来，重组蛋白被应用于不同疾病治疗，其中单克隆抗体（mAbs）是生物治疗类重组蛋白里发展最快的一类。CHO细胞是生产这些重组蛋白应用最广泛的细胞株，表达载体决定重组蛋白的表达量和质量。目前，关于CHO细胞中表达载体的构建策略已经建立，包括：单顺反子载体，多启动子表达载体，以及IRES（内部核糖体进入位点）或Furin-2A（弗林蛋白酶-2A多肽）元件介导的三顺反子载体。其中，Furin-2A介导的载体非常有效，优势表现在自我剪切效率高，同一个开放阅读框相同的轻重链表达量。本篇文章综述了这几种CHO细胞重组单克隆抗体表达质粒构建策略的发展历程及其优缺点。 随着基因工程的发展，重组治疗性蛋白的需求也大幅增加[1,2]。作为一种重要重组蛋白，治疗性mAbs具有特异性和低免疫原性。近几年来，重组mAbs已经成为包括癌症及免疫系统缺陷在内的许多疾病治疗的主导药物[3,4]。至今为止，FDA（美国食品药品管理局）和EMA（欧洲药品管理局）已经批准超过70种治疗性mAbs，其中39种是由CHO细胞生产（见表1），除此之外，还有几百种mAbs处于临床阶段[5]。 重组mAbs，或称基因改造抗体通过转基因技术在多种宿主细胞表达。免疫球蛋白GmAbs（IgGmAbs）包括两条相同的轻链和两条相同的重链。重组mAbs需要折叠、组装及合适地糖基化才具有生物学活性[6]。不同宿主细胞产生的治疗性mAbs显示不同的免疫原性和治疗效果，暗示宿主细胞影响重组mAbs的生物学功能[4]。大肠杆菌表达系统是一种简单的系统，其转录后修饰比较少而且不常见，导致这种系统只适合表达抗体片段或者是单链抗体[7,8]。昆虫细胞、酵母细胞和转基因植物转录后修饰和人细胞不同，导致重组mAbs和人天然mAbs有很大差异[9]。对比其他系统，哺乳动物细胞产生的治疗性重组蛋白具有正确的转录后修饰，相似的分子结构和糖基化，和人体内抗体相接近[10]。因此，除了一些抗体片段，目前市场上的大多数治疗性mAbs使用哺乳细胞生产[11-13]，并且更倾向于使用CHO细胞表达系统。表达载体是CHO细胞表达不同重组蛋白的关键因素，并且决定了mAbs的产量和质量[14]。本篇文章，详述了使用CHO细胞表达系统生产mAbs的表达载体构建最新进展。 治疗性重组mAbs需要合适的糖基化和其他翻译后修饰来实现其生物功能，因此，大多数治疗性重组mAbs使用哺乳细胞来生产，CHO系统最常被用作表达系统[15]。对比其他的表达系统，CHO细胞具有以下优势：（1）更适合悬浮培养，更符合工业大规模生产的需求[16]，（2）生产的mAbs更贴近天然mAbs的结构和功能，（3）在这些细胞中人源病毒不能感染和扩增[17]，（4）外源基因可以稳定地整合到CHO细胞中，（5）分泌低量的内源蛋白，有利于目的重组mAbs的分离纯化[10]。当在CHO细胞中表达治疗性重组mAbs，HC和LC基因需要同时翻译，这点连同细胞系的成功转染都是CHO细胞生产mAbs时面临的重大挑战。 单顺反子载体 最近几年，CHO细胞表达mAbs的表达载体的不同构建策略已经建立（表2）。早期的研究集中在使用独立的载体和表达轻链或者重链序列（图1a）[18,19]。但是，这种策略耗时且困难，准备和高效共转两个载体是个挑战，不仅如此，使用两种筛选标记降低了获得稳定细胞克隆的效率[20,21]，另外，这种低效地将两种筛选标记及目的基因整合进细胞基因组DNA影响轻重链基因的表达。相较而言，瞬时表达使得在哺乳细胞中分析蛋白表达更高效[22]。单顺反子载体瞬时转染用于早期抗体分子的筛选，但是其表达量较双启动子及双顺反子载体的表达量要低[5]。这种可能归因于这种单顺反子载体系统每个多肽链是由各自独立的启动子介导，轻链由于分子量较重链低在转录和翻译上效率更高[23,24]。单顺反子系统的这些不足不仅增加了工作量，而且不适合大规模mAbs生产[25,26]。因此构建多顺反子质粒来实现轻重链及筛选基因在同一个载体上是非常有必要的。 多启动子表达载体 一个多启动子的mAb的表达载体具备不同启动子来分别介导轻重链基因的转录（图1b）。目前，CHO细胞表达系统中应用的启动子主要来源于猿猴空泡病毒40（SV40）、延伸因子-1α（EF-1α）和巨细胞病毒（CMV）。当然EF-1α是最强启动子[27]（表2）。Bayat等构建了使用CMV启动子的单顺反子载体、双载体和双顺反子，用其表达重组的mAbs，发现使用双启动子表达的蛋白产量最高[5]。但是因为在一个多启动子的载体上每个启动子负责一个基因的转录，这可能导致基因表达水平的不均衡[28]。以mAbs为例，这将导致轻重链的表达水平不一致，从而造成两个启动子间的相互干扰或抑制。另外，在许多情况下，多启动子载体的能力有限，很难适合两个以上的转录盒。因此这种方法的适用有限。 三顺反子载体 三顺反子载体在一条mRNA上表达轻重链及筛选标记基因，允许三种基因同时表达，并且将上述使用传统载体的表达问题降低到最低。三顺反子载体的轻重链表达水平相同，这使得mAb的表达水平提高、聚集率低和糖基化一致。两种三顺反子载体，一种利用IRES，另一种利用Furin-2A。 图1：单克隆抗体表达载体构建示意图 A：单顺反子载体，B：多启动子载体表达系统，C：IRES介导的载体，D：Furin-2A介导的载体。GOI：插入基因，PolyA：聚腺苷酸化信号，IRES：核糖体内部进入位点，F2A：Furin-2A。 IRES介导的载体 IRES是一段几百碱基的非编码序列，定位于一些病毒基因组中，通常在RNA病毒的5’非编码端。IRES可以介导一种不依赖5’帽子结构的翻译起始，可以促使单一mRNA转录本上多种基因的表达[28]。在翻译过程中，IRES元件促进非依赖帽子结构的起始和IRES元件下游基因的翻译[29]。在这种策略中，IRES元件插入在轻重链阅读框的中间，整个序列包含重链、IRES和轻链在内都由一个启动子介导转录（图1c）。在翻译阶段，第一个开放阅读框由帽子结构机制介导翻译，在IRES下游的第二个阅读框则一种不依赖帽子结构的机制进行[28,30,31]，因此，达到了一个启动子表达完整重组蛋白的设想。 IRES的使用克服了单顺反子载体和多启动子表达载体出现的不同启动子中间相互干预的问题[32]。单顺反子载体系统中目的蛋白和筛选标记基因处于不同启动子控制下，造成得到表达全部基因的克隆的概率很低[33,34]。本系统中，筛选基因同样使用IRES元件连接，因此轻重链及筛选基因可以在同一个转录本表达，从而增加阳性克隆的概率[18,28]。另外，三顺反子也因该系统轻重链表达水平一致而降低了mAbs的产量[28]。例如，抗肿瘤坏死因子α的mAbs，由CHO细胞IRES介导的三顺反子系统表达，抗体的产量要比双质粒系统显著性提高[35]。但是，Hennecke等发现非帽子结构依赖的翻译效率要比帽子结构依赖型效率低[36]，因此，尽管所有基因处于同一条转录的mRNA，它们的翻译水平也存在差异。因此，目的基因排序设计对于构建mAb的表达载体尤为重要[37]。 Furin-2A介导的载体 2A多肽一种自剪切多肽，首次发现于核糖核酸病毒，主要包括四类，分别来源于手足口病毒（F2A）、马鼻病毒（E2A）、1型猪肠病毒（P2A）和昆虫病毒（T2A）。这种2A序列远小于IRES，只有约20个氨基酸。轻重链间插入2A序列，通过在2A序列的C端最后两个氨基酸GP间共转录剪切，产生独立的轻重链，增加了共表达蛋白的产量（图1d）[37,38]。2A介导的自剪切机制会在核糖体上跳过2A序列C端甘氨酰-脯氨酰的形成[39,40]。 之前的研究表明在2A序列前添加Furin序列可以在剪切后除去多余的氨基酸[41,42]。Furin-2A介导的载体表达mAbs表达量要比IRES介导的载体高，不管其瞬转还是稳转[18,42]。另外，F2A序列的上游基因翻译效率要比下游高[18]，因此重链轻链在F2A序列两侧的安排影响mAb的产量。高的轻链表达量发现与高细胞活率、高mAb产量和低聚集相关[23]。构建多顺反子载体时组合2A和IRES序列会提高效率[30]，但是仍存在很多挑战，首先，Furin-2A自剪切不完全（85-95%），这会降低效率。另外，2A多肽的C端可能影响蛋白的功能和定位[26]。 多种应用于重组mAbs表达载体的构建策略已经建立，一系列的载体已经产生，例如单顺反子载体、多启动子载体以及IRES或Fruin-2A介导的三顺反子载体。这些载体都有自身的优缺点。其中，Furin-2A介导的载体呈现出最有效的表达载体，突出优势是具有高自剪切效率和相等量的轻重链表达量。在未来，我们认为未来的研究需要集中在使用顺式元件增加重组mAb的表达。另外，提高Furin-2A介导的载体的自剪切能力也将是保证轻重链蛋白的准确且相同表达量的优势。 参考文献： Li YM, Tian ZW, Xu DH, Wang XY, Wang TY.Construction strategies for developing expression vectors for recombinant monoclonal antibodyproduction in CHO cells.Mol Biol Rep. 2018 Dec;45(6):2907-2912. 会议推荐 欢迎加入小编团队，请点击 求贤令 - 抗体圈小编 |
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