福利 | 常用商业化载体的图谱解析(Ⅱ)—详解

1  载体必需元件

复制起始位点（Ori）+ 筛选标签（抗性基因等）

Minimal Plasmid Made by Synbio Center: pSC0331A

目前几乎所有的商业化质粒载体的克隆系统都是E.coli（大肠杆菌），因为在丰富培养基中E.coli生长非常快，20 min内就可以复制一代，所以我们通常是在E.coli中完成载体系统的构建和质粒制备，而在目标菌株或其他类型细胞中完成所需基因的表达和其他基因操作，也正因为这个原因，几乎所有的商业化质粒载体都有一套E.coli的复制起始位点和筛选元件。

 

2  载体元件

2.1   Ori（复制起始位点）

任何商业化载体的复制起始位点类别对于质粒构建与克隆都是个非常重要的信息，因为该信息决定了载体的质粒拷贝数（当然也有EPI400这种可以限制质粒拷贝数的特殊菌株），为了载体制备的方便性，绝大多数的表达载体都是高拷贝的，如常用的pcDNA家族载体，而pET家族载体是低拷贝的，因为载体上的Rop蛋白可以让该系列载体维持在低拷贝水平。常用的克隆载体的Ori类别如下列表所示：

非常值得一提的是，在人类基因组测序计划的时代所开发出来的BAC（细菌人工染色体）系统载体，在构建长片段DNA和小规模基因组时有着巨大的优势，因为其单拷贝特征使得质粒的复制对细胞的代谢系统产生的影响是最小的，所以在构建很多对细胞有毒性的基因和基因组时会取得成功，而常规的高拷贝载体很多时候会无法得到正确构建（往往会得到有很多突变或者缺失的构建），甚至是使得克隆宿主菌无法正常生长出单克隆菌落。

2.2  Selection Marker

常用的筛选标记有抗性筛选、ccdB和SacB负筛选、营养缺陷型筛选等等，部分列表如下：

2.3  Ori+筛选标记载体元件的载体举例

2.4  载体元件—RBS

No！No！No！

这里的RBS 是指 Ribosome Binding Site 原核生物，如大肠杆菌的RBS。

Registryof Standard Biological Parts

RBS序列对原核基因的表达至关重要，如果mRNA序列中的CDS序列与RBS序列之间形成了强烈的二级结构，将会非常严重的影响翻译过程，从而造成基因表达量与预期差异巨大。因此，在标准化的原核转录单元序列设计中，应该考虑到RBS的因素，推荐大家使用RBS Calculator计算RBS强度，从而来合理控制所需基因的表达水平。

pET-3a-d cloning/expression region

pET家族载体的RBS序列是固定的，如上图箭头所示

2.5  载体元件 — Kozak 序列

针对真核细胞转录单元的序列设计，需要考虑到Kozak序列的添加，这样基因的翻译水平可能会得到适当增强。脊椎动物细胞中的Kozak序列一般是GCCACC。

2.6  载体元件 — IRES

IRES + the second CDS

IRES + the second CDS 

真核细胞一般不支持多顺反子结构的基因设计，但是在病毒基因组序列中发现的IRES序列可以有特例，如上图中所示的那样，在第一个CDS的终止密码子后面加上IRES序列，那么便可以直接在IRES序列的末端加上第二个CDS进行基因表达，这样就可以实现同一条真核细胞mRNA可翻译出两个不用蛋白质的设计。