【原】鸡胚培养法及血凝实验

鸡胚培养法

一、.实验材料

 (一)7—11日龄鸡胚

 (二)孵卵箱：孵卵箱要有两个，一个39℃，放正常鸡胚用，另一个33—35℃，放接种病毒后的鸡胚。

 (三)照明灯，打孔器和卵盘。

 (四)其它：注射器，针头，消毒剂(2.5％碘酒和75％酒精)，镊子，酒精灯，试管架，蜡和胶布等。

二、接种技术

 (一)活胚检查

鸡胚使用前必须进行检查，可根据以下三方面来判断其活死：

1．血管：活胚可见明显的血管，有时可见血管搏动；死胚血管模糊，成淤血带或淤血块。

2．胎动：活胚可见明显的自然运动，尤其用手轻轻转动卵时。但胎龄大于14天胚胎，胎动则不明显，甚至无胎动；死胚见不到任何胎动，胚发红像出血样，有的呈现黑块。

3．绒毛尿囊膜发育之界线：生活良好之胚胎可见密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成较明显的界线。

    必须把上述三方面结合起来进行观察，如果胚胎活动呆滞或不能主动地运动，血管模糊扩张或折断沉落，绒毛尿囊膜界限模糊，则可判断胚胎濒死或已经死亡。

 (二)接种途径

 尿囊腔接种

    通常选9一11日龄鸡胚，照检后画出气室边界，在气室交界边缘以上约1mm处并避开血管作一标记此即为注射点。在点周围用先用2.5％碘酒消毒，再用75％酒精脱碘。用打孔器在注射点处打一小孔，勿损伤壳膜。用注射器注入样品0.2ml，然后用石蜡溶化封口，置33—35℃培养。于接种后24h内死亡者为非特异性死亡应弃去。

　　培养72h后进行收获。收获前鸡胚须置4℃冰箱6h或过夜，不能置时间过长，过长会引起散黄。如急于收获亦可置-20℃冰箱1h左右，但不能过长，过长会引起鸡胚结冰，再融化时卵黄膜就破碎，卵黄就流出。预冷的目的是，将鸡胚冻死使血液凝固，避免收获时流出红细胞并同尿液或羊水里的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。

　　收获时，用碘酒或75％酒精消毒气室部卵壳，用消毒镊子轻轻敲碎气室部卵壳并取走，再用另一无菌镊子撕去气室部壳膜，然后用无菌注射器通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔，吸取尿囊液，置西林瓶内4℃或低温保存待用。

血凝试验

一．仪器设备：一次性注射器，微量血凝板（V型、96孔），微型振荡器，移液器

二．所需试剂：

（1）稀释液10×PBS（磷酸缓冲液pH7.0～7.2）

氯化钠8.5g，磷酸二氢钾0.68g，氢氧化钠0.15g，上述成分溶于100ml蒸馏水后高压灭菌，于4℃保存，使用时作10倍稀释。

（2）红细胞保存液（阿氏液）

葡萄糖20.5克，氯化钠4.2克，柠檬酸0.55克，柠檬酸钠8.0克 ，溶于1000毫升蒸馏水中，调PH值6.8~7.2，分装，115℃15分钟灭菌，低温保存备用。

（3）1％红细胞悬液

用一次性注射器吸取2ml阿氏液，再直接采成年公鸡翅下静脉血液2ml，混匀，转移到离心管中，用1×PBS洗涤红细胞三次，头两次以1500rpm离心5min，最后一次以2000rpm离心10min。将1ml离心压积后红细胞加入到100mlPBS中或阿氏液中即配成。

三．操作方法：

（1）于微量血凝板的每孔中滴加稀释液1×PBS 50μL，根据被检样品数量定所加排数。

（2）吸取被检尿囊液分别滴加于第一列孔，每个样品50μL，然后由左至右顺序倍比稀释至第11列孔，再从第11列孔各吸取50μL弃之。最后一列不加样品作空白对照。

（3）于每孔中加入1%红细胞悬液25μL。

（4）置微型振荡器上振荡1min，或手持血凝板绕圆圈混匀。

（5）放室温下(18～20℃)30min，观察结果。