本周分享——稳转株细胞构建策略汇总

小波H 2023-10-29 发布于云南

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科学与技术

转染是将外源遗传物质包括质粒、DNA、RNA导入真核细胞的过程，是用于研究基因表达对细胞生理水平的影响以及获得重组蛋白的重要手段。但是将外源核酸转入细胞并进行表达并不容易，它们必须穿过细胞膜这层屏障才能进入细胞质。转染方法多种多样，可分为病毒转染、物理转染和化学转染，物理转染方法包括电穿孔、显微注射和基因枪等，化学转染可使用磷酸钙共沉淀、DEAE-Dx以及阳离子转染试剂如脂质体、PEI等，病毒转染常用的腺相关病毒转染和慢病毒转染。

图片引自Chong Z X, Yeap S K, Ho W Y. Transfection types, methods, and strategies: A technical[J].

瞬时转染和稳定转染

根据外源基因是否会整合到基因组上，将转染分为瞬时转染和稳定转染。

瞬时转染的细胞中，外源基因得以表达但它们并不会整合到细胞的基因组中，也就不会被复制，所以在表达几天后，转染进去的外源核酸会逐渐丢失。稳定转染是将外源基因整合到细胞的基因组的一个过程。外源基因成为细胞基因组的一部分从而得以复制，这就是稳定转染细胞的标志。稳定转染细胞的子代细胞也同样表达外源基因，由此形成稳定转染的细胞系。

图片引自Kim T K, Eberwine J H. Mammalian cell transfection: the present and the future[J]. Analytical and bioanalytical chemistry, 2010, 397(8): 3173-3178.

稳定转染的基本策略

稳转株表达将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，用载体中所含的抗性标志进行筛选。最常用的真核表达载体的抗性筛选标志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，最终筛选得到可稳定表达目的蛋白，或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。

1、 GS筛选

谷氨酰胺合成酶(GS)催化谷氨酸和氨合成谷氨酰胺，在哺乳动物体内这是谷氨酰胺形成的唯一途径，谷氨酰胺是哺乳动物细胞生存必不可少的，一些哺乳动物细胞系不能够内源性的表达足够的谷氨酰胺合成酶，所以不额外添加谷氨酰胺时不能存活。而另外一些细胞系，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，可以表达足够多内源性的谷氨酰胺合成酶来维持生存，不需要额外添加谷氨酰胺。在这种情况下，可以用GS抑制剂蛋氨酸亚氨基代砜(methioninesulfoximine,msx)来抑制内源性的GS活性，这样只有含外源GS基因的转染细胞才可以存活，这就是GS系统筛选的原理。

2、 DHFR筛选系统

二氢叶酸还原酶基因(DHFR)是具有基因扩增功能也就是能够增加拷贝数的一种筛选基因。当携带DHFR基因的表达质粒转染CHO-DHFR-细胞后，可以得到在选择培养基生长的细胞克隆（这里的CHO细胞是指DHFR缺陷型的细胞，不含二氢叶酸还原酶基因，不能合成核酸，必须在含有HT的培养基里生长），DHFR可被也算类似物氨甲喋呤（MTX）所抑制，不断提高MTX的浓度，绝大多数的细胞会死亡，通过反馈调节的作用，使得DHFR基因自我扩增，连带其上下游的100-1000kb的基因都会扩增。如此目的基因也得到扩增，即可提高目的蛋白的表达量。

3、G418筛选系统

G418是一种氨基糖类抗生素，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质的合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵植物和哺乳动物细胞，是稳转最常用的试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组后能启动neo基因编码的序列转染mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗体而能在含有G418的选择性培养基中生长；并且G418本身具有很好的杀菌效果，所以用G418在筛选过程中是很少出现污染的。

4、博来霉素筛选

博来霉素（Zeocin）是一种铜离子螯合的糖肽抗生素（来源于链霉菌Streptomyces verticillus的突变株），铜离子的存在使其呈蓝色，此铜螯合的形式为无活性。当抗生素进入细胞后，二价铜离子（Cu2+）被还原为一价铜离子（Cu+），并被细胞内的巯基化合物去除。铜离子被去除后，Zeocin被活化，嵌入DNA使其断裂，最终导致细胞死亡。博来霉素常用作一种非常有效的工具抗生素，常用于筛选携带Sh ble基因的宿主，该基因编码的蛋白能够与Sh ble 基因筛选抗生素相结合, 从而抵消其破坏DNA的能力。

5、慢病毒筛选

传统质粒载体受制于质粒大小、转染介质的限制，对很多细胞转染效率低，而且质粒整合入细胞基因组的效率极低，所以构建稳转株的成功率不高。由于慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，并且在感染后容易整合到受感染细胞的基因组，进行长时间稳定表达，因此，目前，医学研究领域已广泛采用“慢病毒感染——药物筛选法”进行稳转细胞株的构建，其已成为构建稳转细胞株最主流的方法。慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。慢病毒主要结构是2个调节基因：包括tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用以及rev基因，病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达；另外还有4个辅助蛋白基因：包括vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生，vpr和nef参与疾病的表现。

图片引自Mátrai J, Chuah M K L, VandenDriessche T. Recent advances in lentiviral vector development and applications[J]. Molecular therapy, 2010, 18(3): 477-490.

6、转座子筛选

PB两端各有一个13 bp和19 bp的反向末端重复序列(inverted terminal repeat, ITR)，中间编码一个长594个氨基酸残基的转座酶。根据转座酶的转录方向来区分转座子的两个末端，两端最外侧各有长13 bp并且对称的ITR，内侧各有一段间隔区(spacer)，但并不对称(左端长3 bp，右端长31bp)，再靠内侧是各长19 bp且对称的亚末端反向重复序列(subterminal inverted repeat, STR)。反向重复序列的5'有2~3个C碱基，对应3'端的G碱基在选择剪切位点过程中均起作用，PB转座系统的插入位点为TTAA，但不是AT富含区。

图片引自Yusa K. piggyBac Transposony[J]. Mobile DNA III, 2015: 873-890.

piggybac(pb)转座子系统主要通过“切割-黏贴”(cut-paste)机制发生转座，不会在转座发生后在原位点留下印迹(footprint)，被越来越多地改造后用于基因组研究、基因治疗、细胞治疗、干细胞诱导和诱导后分化等领域,但是这一过程是可逆的，因此只要当piggybac酶的表达在持续进行，已经整合到基因组上的转座片段还可能被重新切割下来，造成基因组不稳定，实质上降低了转座效率。