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PD-1（程序性死亡受体-1）是表达在T细胞表面的蛋白，可以与肿瘤细胞表面的PD-L1（程序性死亡配体-1）结合，从而抑制效应T细胞的增殖以及细胞因子的分泌，抑制机体的抗肿瘤免疫过程。降低T细胞中PD-1的表达量可以抑制PD-L1与PD-1的结合，增强机体的免疫抗肿瘤活性。 文章首先利用网络药理学对桔梗的有效成分及潜在作用靶点进行分析，将35个潜在活性成分及175个靶点构建C-T图，对图中靶点进行分析，其中度值最高、核心性最高的两个成分为桔梗素D（PD）及桔梗素D3（PD3）。对桔梗提取物进行液相分析，结果显示PD及PD3的含量为1.5：1。因此选择PD：PD3=1.5：1的混合物代表桔梗有效成分进行活性研究。
接着选择体外抗肿瘤实验中效果最好的LLC细胞进行体内抗肿瘤实验，下图表示为体内异位瘤实验的实验操作。 选择5-7周的C57小鼠，适应性喂养7天后，以5×105/只的数量在腋下位置接种LLC细胞，接种后3天，将成瘤的小鼠随机分为生理盐水组、桔梗给药组和紫杉醇给药组3组，之后每两天测量小鼠体重以及肿瘤体积。在第20天时，每组选择一半的小鼠处死并称量肿瘤重量。剩下的小鼠继续饲养，计算每组的存活情况直至第42天。
下图C表示给药后各组小鼠肿瘤体积的变化情况，结果显示桔梗给药组及紫杉醇给药组较空白对照组肿瘤体积均有明显下降。图D表示第20天各组小鼠肿瘤重量，结果显示桔梗给药组及紫杉醇给药组肿瘤重量均小于空白组，且具有统计学差异。说明桔梗有效成分可以显著抑制体内LLC肿瘤的生长。图E表示各组小鼠的生存情况，结果表示桔梗给药组及紫杉醇给药组均可以延长C57肿瘤小鼠的生存时间。 这部分实验结果证明桔梗有效成分具有体内抗肿瘤活性。
网络药理学靶点富集结果显示，桔梗有效成分抗肿瘤作用可能与CD8T细胞有关。因此对肿瘤微环境中的CD8T细胞进行进一步研究。 对肿瘤微环境中的CD8T细胞数量进行流式分析，结果显示，桔梗有效成分给药后，CD8T细胞数量明显上升，结果见图B。
INF-γ和颗粒酶B（GZMB）是CD8T细胞分泌的两种具有抗肿瘤活性的细胞因子，给予桔梗有效成分后，两细胞因子分泌量明显升高，见图C和图D。
PD-1是程序性死亡受体，与肿瘤分泌的PD-L1结合后会抑制CD8T细胞抑制肿瘤的活性。桔梗有效成分给药之后，CD8T细胞表面的PD-1表达量明显下降，见图E和图F。
以上实验证明，桔梗有效成分可以增加CD8T细胞的数量，增加细胞因子IFN-γ、GZMB的分泌，降低PD-1的表达量，从而增强机体的抗肿瘤免疫活性。 接着对桔梗有效成分降低PD-1的表达量进行研究。 向离体脾脏细胞中加入不同浓度的桔梗有效成分，培养48h后，对细胞进行流式分选，结果显示，CD8T细胞数量以及PD-1的表达量给药前后无明显变化，结果见下图A，图C。说明，桔梗有效成分无法直接作用于脾脏细胞上增加CD8T细胞数量以及影响CD8T细胞中PD-1的表达水平。
文献研究表明，VEGF-A-VEGFR-2轴可以影响T细胞中PD-1的表达，选择体外VEGF-A表达量比较高的CT-26细胞及LLC细胞研究桔梗有效成分对VEGF-A表达的作用。结果显示，桔梗有效成分可以显著抑制CT-26细胞（见图E）及LLC细胞（见图B、图C）中VEGF-A的表达量。
进一步研究桔梗有效成分对VEGF-A的影响是否会影响CD8T细胞中PD-1的表达。首先按下图F制备肿瘤条件培养基，加入标记好的T细胞96孔板中，进行流式分选。结果显示，不同给药的肿瘤条件培养基可以显著增加CD8 T细胞的数量，抑制CD8T细胞中PD-1的表达，且具有剂量依赖性，见图D、图E。
由此得出结论：桔梗有效成分可以通过VEGF-A–VEGFR-2轴间接降低CD8T细胞上的PD-1的表达量，增强机体抗肿瘤免疫活性。 |
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