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家人们，小薇又来啦！小薇最近在PubMed冲浪时，发现了一篇探讨肿瘤临床预后的文章。所以小薇这不马不停蹄得来给大家安排上！这篇11 高分文章主要探讨了在肾细胞癌临床预后中起重要作用的M2巨噬细胞相关基因TRAF2的潜在功能和机制。研究者使用多种分析方法及各类实验：采用加权基因共表达网络分析、LASSO建立风险预测模型，通过RCT qPCR、蛋白质印迹等方法测定关键基因TRAF2表达模式和临床意义，采用GSEA分析、透射电子显微镜等来研究TRAF2、M2巨噬细胞的潜在功能和机制。最终构建出基于M2巨噬细胞相关基因的ccRCC患者预后风险模型。这一预后风险模型具有准确、稳定地预测患者预后的能力，有望促进ccRCC患者疗效评价和综合管理的提高。此外，该研究利用大量证据提示TRAF2是晚期ccRCC的潜在新治疗靶点。小薇发现这篇文章研究思路逻辑严密，由M2巨噬细胞出发一步步抽丝剥茧般发现关键基因TRAF2，辅以大量实验佐证结论，使得晦涩难懂的机制类文章都变得容易理解。接下来就跟着小薇的步伐看看这篇文章的具体内容吧！（ps：科研显微镜持续为大家带来最新科研文章思路，想复现这种思路或者定制更多创新性思路欢迎直接扫码call小薇） 
l题目：TRAF2 通过抑制透明细胞肾细胞癌自噬促进 M2巨噬细胞浸润、血管生成和癌症进展 l杂志：J Exp Clin Cancer Res. l影响因子：IF=11.3 l发表时间：2023年7月 公众号后台回复“123”，即可领取原文，文献编号-20231124 研究背景 透明细胞肾细胞癌（ccRCC）的管理是临床实践的一大挑战，构建可靠的预后预测模型和进一步阐明肿瘤进展的关键分子机制是亟待深入研究的课题。研究目的 构建一个新的ccRCC预后风险分层模型，研究TRAF2、M2巨噬细胞的潜在功能和机制。研究思路 研究者从M2巨噬细胞出发，筛选出M2巨噬细胞差异表达基因（M2 MRGs）。基于此构建风险预测模型及生存率列线图。从TRAF2基因出发，发现其上调与患者临床预后不良有关，探究其对ccRCC患者细胞的增殖、迁移和侵袭及一系列的对肿瘤发生的影响及作用。 
研究结果 M2巨噬细胞相关差异表达基因的鉴定及功能注释 研究者首先分析肿瘤浸润性免疫细胞表达谱，得到与M2巨噬细胞最相关的9个基因如图 1A所示。M2 MRGs与M2巨噬细胞之间的调控网络如图 1B所示。基因本体（GO）分析显示，M2 MRGs主要富集于与免疫浸润相关的生物过程（图 1C），包括T细胞活化、白细胞活化、白细胞-细胞粘附等。 
图 1 M2巨噬细胞相关差异表达基因(DEGs)的鉴定及功能注释 构建与验证基于M2 MRGs的风险预测模型 ccRCC进展相关基因与M2 MRGs相交后发现10个基因在两个基因集中共存（图 2A）。研究者构建了基于M2 MRGs的ccRCC患者风险预测模型。5个M2 MRGs（TRAF2, CD7, MFSD1, NFKB2, BCAT1）被确定为特征基因的最佳候选（图 2B, C），高危患者的总生存期（OS）较低危患者差（图 2D-E）。获得风险评分的患者死亡比例增加，间接增加了风险分层模型的可信度（图 2G）。该模型的预测能力显著高于一般临床因素（图2H）。该模型预测的ccRCC患者1、3、5年生存分别为0.847、0.780、0.784（图 2I）。将风险模型与年龄、性别结合进行生存分析均支持风险分层模型稳定可靠（图 2J-L）。低风险I-II期患者预后好于低风险III-IV期患者，高风险I-II期患者预后好于高风险III-IV期患者（图 2M）。总之，基于M2 MRGs风险预测模型具有准确、稳健预测ccRCC患者预后的能力。 
图 2 构建与验证基于M2 MRGs的风险预测模型 构建预测ccRCC患者生存率的列线图 列线图是预测患者临床预后的定量模型。研究者根据风险评分和其他临床特征绘制列线图计算ccRCC患者在1、3、5年的OS概率（图 3A）。校正分析表明预测结果与实际观测结果一致（图 3B）。此外，研究者发现高危组患者的无进展生存（PFS）率低于低危组（图 3C）。构建预测ccRCC患者1、3、5年PFS的列线图（图 3D）。综上，预后预测模型在预测ccRCC患者的临床预后方面表现良好，有望用于临床患者的管理。 
图 3 预测ccRCC患者生存率的列线图的构建 ccRCC中TRAF2的上调与临床预后不良有关 研究者使用热图分析5个模型组成基因（TRAF2、CD7、MFSD1、NFKB2和BCAT1）的表达模式，发现TRAF2的差异表达在5个基因中最为显著，并且在几乎所有高危患者样本中均上调（图 4A）。ccRCC样本和非癌样本的基因表达差异分析显示与正常组织相比，ccRCC组织中TRAF2异常升高（图 4B）。RT qPCR实验结果显示与非癌组织相比，TRAF2在ccRCC组织中异常升高（图 4C）。ccRCC组织中TRAF2蛋白水平高于其邻近的非癌组织（图 4D）。免疫组化染色结果显示TRAF2主要在ccRCC细胞的细胞质中异常升高（图 4E）。TRAF2 mRNA和蛋白水平在ccRCC细胞系中高于HK2细胞（图 4F）。Kaplan-Meier分析显示TRAF2高表达患者总体10年生存率低于TRAF2低表达患者（图 4G）。多因素Cox回归分析显示TRAF2是ccRCC患者预后的独立预测指标（图4H）。综上TRAF2在ccRCC中表达上调，TRAF2可能是ccRCC患者的独立预后因素。 
图 4 ccRCC中TRAF2的上调与临床预后不良有关 TRAF2在ccRCC细胞中促进细胞增殖、迁移和侵袭 研究者通过RT-qPCR（图 5A）和Western Blot检测（图 5B）证实TRAF2在OSRC2和CAKI2细胞中被稳定敲低。结果显示TRAF2被shRNAs耗尽导致细胞增殖和集落形成下降（图 5C），TRAF2缺失导致软琼脂生长下降（图 5D）。迁移实验和侵袭实验结果表明TRAF2敲低导致肿瘤细胞的迁移和侵袭能力下降（图 5E-F）。总之结果表明TRAF2在ccRCC的肿瘤发生中具有致癌作用。 
图 5 TRAF2在ccRCC细胞中促进细胞增殖、迁移和侵袭 TRAF2通过调节巨噬细胞极化、迁移和血管生成来促进ccRCC的进展 M2巨噬细胞表达CD206和CD301的水平高于M1巨噬细胞。研究结果显示在肿瘤样本中TRAF2的表达与CD206和CD301呈正相关（图 6A）。THP-1细胞被成功诱导分化为巨噬细胞样细胞（图 6B）。TRAF2的下调抑制了巨噬细胞向M2的极化（图 6C）。TRAF2缺失导致OSRC2和CAKI2细胞中VEGFA蛋白的降低（图 6D），导致共培养HUVECs细胞血管生成和迁移受损（图 6E-F）。总之TRAF2通过调节巨噬细胞极化、迁移和血管生成来促进ccRCC的进展。
图 6 TRAF2通过调节巨噬细胞极化、迁移和血管生成来促进ccRCC的进展 TRAF2通过自噬依赖途径诱导巨噬细胞极化 GSEA分析结果显示TRAF2高表达的样本中自噬信号通路丰富（图 7A）。TRAF2缺失导致自噬体增加，因此自噬活性被激活（图 7B-D）。TRAF2缺失导致CD206和CD301 mRNA减少，雷帕霉素治疗部分改善了这种减少作用（图 7E）。自噬激活剂逆转了TRAF2缺失对M2巨噬细胞极化抑制的作用（图 7F-G）。自噬激活剂部分逆转了TRAF2缺失引起的VEGFA蛋白下降（图 7H）。自噬激活剂部分逆转了TRAF2缺失引起的巨噬细胞迁移减弱（图 7I）。 
图 7 TRAF2通过自噬依赖途径诱导巨噬细胞极化 TRAF2对ccRCC的肿瘤发生和转移至关重要 小鼠发光成像监测结果显示TRAF2缺失导致肾肿瘤生长减少（图 8A-B）。与对照小鼠相比，TRAF2缺失组小鼠的肿瘤负荷减轻（图 8C）。小鼠原位移植模型中TRAF2缺失降低了肿瘤生长（图 8D）、肿瘤重量（图 8E）和肿瘤细胞Ki67阳性率（图 8F-H）。发现TRAF2缺失抑制了肺转移（图 8I-J）。 
图 8 TRAF2对ccRCC的肿瘤发生和转移至关重要 文章小结 这篇11 高分文章构建了基于M2巨噬细胞相关基因的新型预后预测模型，该模型被确定为ccRCC患者准确、独立和特异性的预后风险模型。并且确定了TRAF2是ccRCC中上调并且与不良的临床预后相关的关键基因。研究者利用多种制作精美的图片展示结果，使得结果清晰直观，读者可读性强。整个研究过程思路严谨，实验及研究过程一环套一环，逐步深入，具有极强的证据支撑。因此，感兴趣、有了想法的同学赶紧行动起来吧！撰写属于你自己的SCI文章吧！（ps：想了解更多科研思路、科研写作相关信息记得关注科研显微镜公众号哦！）
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