病原体宏基因组高通量测序医院实验室本地化之路：现状和挑战

来源：唯菌论

摘要

病原体宏基因组高通量测序（mNGS）检测流程高度复杂，对环境、设备和人员技术能力要求高。如何在本地化有序发展、规范管理及合理使用 mNGS 技术，是从业者必须审慎对待的科学课题。基于此，浙江大学医学院附属第一医院检验科韩东升、中国科技大学附属第一医院检验科马筱玲、同济大学附属东方医院南院检验科吴文娟三位专家2022年2月于《中华检验医学杂志》发表了“病原体宏基因组高通量测序医院实验室本地化之路：现状和挑战”一文，对 mNGS 医院实验室本地化系统的建立模式，检测系统的分析性能确认，来自生物因子、检测流程、生物信息学分析及信息传输的风险管理，以及适用于临床的病原体数据库、生物信息学分析人才和诊断报告的需求等几个层面的问题进行了思考和讨论，以促进 mNGS 在医院内的规范应用和健康发展。

在我国，病原体mNGS行业在产品转化速度和临床应用规模两方面均领先国外。近年发表的系列专家共识在 mNGS 检测实验室环境和人员要求、临床适应证、标本采集和运送、核酸提取、 建库和测序、生物信息学分析和结果报告、性能确认方法、质量控制要求等方面均进行了阐释并提出推荐建议，可协助指导 mNGS 本地化系统的建立。

一

病原体mNGS医院实验室本地化的主要形式

目前mNGS医院实验室本地化主要有医院独立建设以及体外诊断（IVD）企业与医院联合共建2种形式。

二

病原体mNGS医院实验室本地化系统的建立

不同实验室在mNGS技术应用方面各有优势：分子生物学实验室有标准化的实验室环境及熟练的分子生物学实验操作人员；研究性实验室更加注重mNGS检测数据的挖掘和检测项目的拓展；微生物实验室工作人员有较为丰富的临床微生物专业知识，具有一定的鉴别定植菌和致病菌的能力；临床科室医师能够正确掌握检测适应证并结合临床信息对检测结果进行正确判读。综合考虑，在该文章中笔者建议病原体mNGS应优选具有基因扩增资质的标准化分子生物学实验室，由微生物实验室参与，与临床科室合作，完成mNGS的检测和报告全过程。

三

病原体mNGS检测系统分析性能确认

医院实验室在建立mNGS检测的过程中，需要分别完成包括样本处理、核酸提取、文库构建和测序步骤的“湿实验”流程以及包括生物信息学分析和结果报告的“干实验”流程的性能评估，确定关键步骤中的关键参数。

1	“湿实验”中，需要明确不同样本类型的最佳处理方式（储存及运输方式、使用体积及标本性质等），选用的核酸试剂盒对各类微生物提取效率的具体影响，文库构建的核酸输入量和最佳文库浓度，是否需要扩增及扩增循环次数，测序量及测序质量等。
2	“干实验”流程中，需要明确数据的过滤规则，基于序列（数目、覆盖度、置信度等）和临床相关性的不同类型微生物的判读标准等。
3	随后，应需要完成整个mNGS检测系统（全流程）的分析性能确认。性能确认的指标应包括但不限于分析敏感性（检出限）、精密度、准确性、分析特异性（包括抗干扰能力）等。如果实验室可检测多个样本类型，那么需要对每种样本类型分别进行性能确认。

四

病原体mNGS风险管理

病原体mNGS过程包含多种设备、试剂和多个操作环节，在基于实验室个体化风险评估的基础上，进行风险管理是保障系统顺畅运行的必要条件。风险评估包括危害发生的概率和危害严重程度，病原体mNGS的风险主要来自生物因子、检测流程、生信分析及信息传输3个方面。

01

生物安全的风险

病原体 mNGS 的检测对象是引起感染性疾病的患者标本，因此病原体mNGS实验室与从事肿瘤和遗传性疾病高通量测序检测的实验室不同，首先要评估生物安全风险。需要按照病原微生物实验室生物安全的管理，严格执行有关标准规范，严格管理实验样本、实验材料、实验活动废弃物。

02

检测过程的风险

mNGS是复杂的多步骤测试，每个步骤操作是否规范直接影响试验结果，所以检测过程中的风险识别和风险控制就更为复杂和重要。

基于本实验室的风险评估，建立mNGS检测全过程质量控制方案是风险管理至关重要的举措 。质量体系需要包含多个质量指标，包括样品对照、外部对照、内部对照、文库质量指标、测序质量指标和污染对照。实验室可以定义每个参数的质量目标，以确保标本质量和检测质量。

1	当临床样品对照和外部对照（阴性质控及含有代表性病原体的阳性质控）失控时，应分析原因并重新检测；
2	每批样本应添加已知序列和浓度的内部样本质控，当内部对照的检测值与理论值偏差大于允许范围时，应分析产生偏差的原因及偏差对结果的影响程度，再决定是否发送当前批次样本的结果报告；
3	文库构建完成后，分别检测文库片段长度及文库浓度，如有异常，中止上机检测；只有当测序生成的数据总量（~M）和reads质量值（Q20，Q30等）等达到预设的阈值时才能进行下一步的生物信息学分析；
4	还应设计无模板对照样本用于监测实验室环境背景微生物、建库和检测试剂工程背景菌的组成及变化规律，建立实验室污染微生物控制基线。

03

生信分析及信息传输的风险

现有的mNGS平台根据不同的序列比对或物种分析工具（如 BWA、Taxonomer 和 Kraken2）和参考数据库（NCBI NR/NT/RefSeq 数据库）开发商品化的生物信息学软件。 由于 NCBI 公共数据库包含所有已知生物的序列信息，测序得到的低质量序列（即噪音）易比对到 NCBI 数据库中低复杂度/错误注释/污染的序列而导致假阳性结果，引向错误治疗方向。实验室通常需开发并验证一套完整的自动化生信分析流程来减少过滤这类假阳性结果。

1	对于低浓度文库，样本中的背景信号往往会被放大，这会增加生信分析工具鉴别致病与污染微生物的难度，所以需建立本地化实验室的背景微生物数据库并设置检测阈值过滤污染，提高特异性。
2	仅通过智能化的生信分析工具，可能存在漏报或错报有意义病原微生物的风险。当遇序列数少的可疑微生物，需综合考虑其他微生物检测结果、相关的临床生物标志物、影像学信息和临床诊断，多学科合作来评估检测结果的临床意义。
3	当mNGS检测到严格致病菌，如结核分枝杆菌、军团菌、诺卡菌等，及时通过实验室信息系统或其他途径与临床医生沟通，可有效降低结果延迟和治疗延误的风险。

五

mNGS医院实验室本地化存在的技术挑战

01

mNGS本地化对数据库的要求

参考数据库是影响mNGS检测结果准确性的重要因素，因此应根据其技术特点和临床需要建立与之匹配的病原体数据库。目前大部分实验室都是在公共数据库的基础上自建适合预期用途的内部参考数据库。在构建、使用和管理这类数据库时需要考虑几个方面的问题。

1	使用本地化服务器的实验室，构建的数据库大小需要考虑到计算机资源的分析能力；
2	需要考虑数据库的全面性以及纳入物种在分类学上的代表性。对于同一微生物，往往具有遗传差异的不同亚型或株，所以在选择基因组时，应该考虑到微生物的遗传多样性，尽可能多地纳入不同亚型或株的高质量基因组；
3	无论所选参考基因组的来源如何，实验室都需要确认其注释的准确性和序列的完整性，拒绝注释错误、命名错误或代表性不足的临床相关微生物序列入库；
4	有必要在数据库中对纳入的每一个微生物的潜在临床意义进行注释，让结果解读人员对检出的微生物有基本的认识和判断；
5	由于病原体（特别是病毒）在自然状态下是不断发生进化变异的，致病性也是动态变化的，所以需要及时（或定期）对参考数据库中的基因组信息及其临床致病证据进行更新；
6	发生可能影响结果的数据库修改、替换及更新等活动均需要重新进行性能评价；
7	同时需要对所使用过的数据库进行版本控制，以便每批次样本检测结果的溯源。

02

mNGS本地化对生物信息学人才的需求

目前，对于医院内的临床实验室而言，由于普遍缺乏生信人才，仅仅依靠检验人员和临床医生完成生物信息学分析流程的开发、建立、验证、更新和维护是不现实的。除加大引进专业生信人才的力度外，还可以通过2个途径缓解医院内实验室生信人才缺乏的困境：

（1）与具有训练有素的生信开发人员的公司或科研机构合作，构建并验证一套符合预期用途的本地化mNGS生信分析流程，并对实验室人员进行必要的生物信息学基础理论、流程操作使用及维护等方面的培训，确保日常运行。涉及复杂算法的优化及更新仍需要专业的生物信息学人员参与；

（2）目前市场上也逐渐出现商业化的用户友好型mNGS数据分析流程，可减少对生信人员的需求，但是实验室必须采取足够的措施来保护测序数据中患者的序列信息不被泄露或破坏。

03

mNGS本地化对临床诊断报告的追求

目前还没有统一的mNGS结果报告标准，实验室往往综合微生物序列数目、基因组覆盖度、相对丰度和微生物的临床相关性等标准形成一套内部的结果解读规则。实验室报告发放人员需要具有一定的临床、感染及临床微生物学知识和经验。必要时，需针对病情进行讨论或电话会议的方式与临床医生沟通后再形成报告。对于疑难病例或复杂的mNGS结果，强烈建议建立由具有分子生物学、临床感染病学、临床微生物学和生物信息学等专业人员组成的跨学科专业团队，结合患者临床背景资料及其他的实验室检查结果进行综合判断，给出合理的病原学诊断决策。必要的时候，需要依靠传统方法（如培养、血清学检测、组织病理学等）和其他分子检测方法如聚合酶链反应、一代测序等进行佐证。

在报告格式上，mNGS本地化检测报告应该符合医院内常规检验报告格式要求，包括必要的患者基本信息、样本类型、样本量和性状、检测结果及临床意义、检测局限性、检测人员和实验室信息等部分。

在报告的内容上，应该易于理解，又便于阅读，只需要报告通过判读规则的临床相关或潜在相关的微生物信息，并解释其临床意义，不应向医生报告实验室环境及试剂污染物、错误匹配及人内源性逆转录病毒等没有意义的鉴定结果。

病原体mNGS检测已经开启医院本地化建设的新篇章。正如新型冠状病毒核酸检测广泛应用中需要深入强化管理和定期督导，如何规范有序发展具有高度复杂性的mNGS技术，是从业者必须审慎对待的科学课题。理想的诊断方法应具备灵敏度高、重现性好、快速以及尽量使用无创性标本等特点，目前mNGS仅用作传统检测方法的补充手段。在不久的将来，随着数据库的同质化、解释标准的确定、核酸提取方案的改进、周转时间的缩短、AI的有效整合以及成本的大幅降低，病原体mNGS有望逐步成为临床感染病实验诊断的有力工具之一。

参考文献：

病原体宏基因组高通量测序医院实验室本地化之路：现状和挑战， 中华检验医学杂志 2022 年 2 月第 45 卷第 2 期   Chin J Lab Med, February 2022, Vol. 45, No. 2