【原】shRNA、siRNA脱靶效应的概念、产生原因、预测、预防措手不及

小小医生孙丹雄 2024-02-05 发布于云南

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常记溪亭日暮，沉醉不知归路。

公众号：小小医生之有趣的医学

Nature杂志：2023年，超过1万篇SCI高级论文撤搞。

网址：https://pubmed.ncbi.nlm./38087103/

中国作者撤稿占到所有SCI论文撤稿的49.86%！

中国撤稿率23.5%。

前言

无言！

独上西楼！

01 概念

小干扰RNA（Small interfering RNA；siRNA），有些地方也叫短干扰RNA（short interfering RNA）或沉默RNA（silencing RNA），是一个长20到25个核苷酸的双股RNA (double strand RNA， dsRNA)。它可以干扰相应的mRNA，防止翻译。

siRNA进入细胞，被整合到其他蛋白质中以形成RNA诱导的沉默复合物（RISC），然后siRNA就展开形成单链siRNA，单链siRNA可以扫描并找到互补的mRNA，诱导mRNA切割，导致mRNA的降解，阻止mRNA翻译成蛋白质，从而沉默编码该mRNA的基因。

RNA干扰过程中，siRNA和mRNA特异结合能够使得靶基因沉默。但研究证实，siRNA 可能与非靶基因结合而导致非靶基因沉默，这种现象称为siRNA 脱靶效应。

比如，针对SB基因（shuang biao基因），设计一段siRNA系列，从而敲低SB基因。但是，这段siRNA系列，其实也可能会与BT基因（bian tai 基因）结合，干扰它，敲低BT基因，出现相应的生物学行为改变。这就是让人无语的siRNA 脱靶效应，脱靶可能导致无法正确解释基因功能。

siRNA 作用过程中存在非特异性，有时候会与非靶基因之外的其它基因作用而非特异地阻断基因表达，产生意料之外的效用称为 siRNA 脱靶效应(off-target effects，OTEs)。目前已知脱靶效应在 mRNA 水平和蛋白质表达水平上都能够检测出来。

脱靶可能与模体匹配、结构和长 CSRNA 等有关。

shRNA: 短发夹RNA（short hairpin RNA），是一种依赖茎环序列产生的短双链RNA结构（19-25nt），可利用载体导入细胞当中，在细胞中经酶切形成siRNA，通过RNA干扰途径调控目标基因。有证据表明shRNA的脱靶效应比siRNA的少。

shRNA的序列在线设计：BLOCK i T RNAi Designer

https://rnaidesigner.

打不开TMD网页！

02 脱靶原因

siRNA与非靶基因存在序列匹配：有时候，碱基错配，少于11个碱基，也可能会敲低基因。甚至，一个siRNA可能存在几百个靶基因。

siRNA与非靶基因的3'UTR序列存在匹配的模体：例如，在人体 HeLa 细胞等多种细胞的 siRNA 传染实验中，大部分沉默的非靶基因序列的 3'UTR 区和 siRNA 的种子区域(Seed Region)的序列互补。

mRNA菊部二级结构的影响。

长的双股RNA的影响。

03 预测

计算机预测速度快，但是准确性欠佳，实验室方法更准确，但是价格昂贵。

一些预测脱靶基因的软件如 siRNAScan 、dsCheck。DsCheck 能够对长 dsRNA 进行分析，按照脱靶效应的大小快速列出候选的脱靶基因。

04 减少脱靶效应

通过利用 siRNA pool、化学修饰和生物信息学方法、优化siRNA设计，能够尽可能地降低脱靶效应，提高 RNAi 实验的质量。

很复杂。

siRNA pool：就是把多个siRNA混在一个池子里干扰靶基因，siRNA之间互相竞争，或许可以减少脱靶效应。

05 注意

脱靶效应，不是脱靶！

另外，除了转录后水平的沉默，RNAi还存在另一种作用方式：甲基化靶基因。siRNA与染色质作用促使靶基因启动子区域甲基化，抑制目的基因转录，即在转录水平上将目的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing，TGS)，不过这种方式不够稳定，也不具备可遗传性。

siRNA各碱基在与靶mRNA发生部分错配的情况下同样起到抑制效果。

06 现实中的处理

采用多个siRNAs靶向同一基因，每个siRNA有独特的脱靶类型，但对相同的靶，可观察到相同的表型，提高结果的可信度。

网上查到的一些资料：慢病毒构建稳转细胞系是目前最常规的稳转株构建方法，可以介过表达，也可以搞shRNA敲低基因，一般经过1-2周的筛选，细胞即可实现稳转。后续实验培养尽量控制传代次数，且定期加入对应抗性做压力筛选，保持导入基因表达的稳定性。shRNA干扰稳转系在超过10次传代之后，干扰水平会显著降低，这可能和细胞的代谢补偿及导入序列被甲基化修饰导致的。