【原】单核RNA测序揭示了杜氏肌营养不良的退行性和再生途径

健明 2024-02-24 发布于广东

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文章概述

文章标题：《Degenerative and regenerative pathways underlying Duchenne muscular dystrophy revealed by single-nucleus RNA sequencing》

发表日期和杂志：2020年发表在PNAS上

在线阅读链接：https:///10.1073/pnas.2018391117

疾病简介及单细胞实验设计

杜氏肌营养不良症(DMD)是一种致命的肌肉疾病，其特征是多核肌纤维的变性和再生周期以及多种其他肌肉相关细胞类型的病理激活。肌纤维共用细胞质内的不同细胞核在多大程度上可能表现出转录多样性。

文章描述了由肌营养不良蛋白基因51号外显子缺失引起的DMD小鼠模型的创建，对肌营养不良蛋白51外显子缺失的小鼠骨骼肌进行了单核转录组学研究。

单细胞转录组数据情况

单细胞数据量较少且分析较为简单，大家可以试试看。

数据链接是：https://www.ncbi.nlm./geo/query/acc.cgi?acc=GSE156498

#samples
GSM4732631 TA_WT snRNA-seq
GSM4732632 TA_D51 snRNA-seq

提供的是10X标准格式的三个文件，选择下载原始的数据矩阵信息之后，使用Read10X()读取即可

#整理样品所在位置
samples=list.files("./GSE156498_RAW/outputs/")
samples
dir <- file.path('./GSE156498_RAW/outputs/',samples)
names(dir) <- samples
#读取数据创建Seurat对象
counts <- Read10X(data.dir = dir)

sce.all = CreateSeuratObject(counts,
                             min.cells = 5,
                             min.features = 300 )

dim(sce.all)   #查看基因数和细胞总数
as.data.frame(sce.all@assays$RNA$counts[1:10, 1:2])
table(sce.all@meta.data$orig.ident)  #查看每个样本的细胞数
head(sce.all@meta.data)

后面就是标准分析啦,对读取进来的数据进行质控、harmony整合以及单细胞细分亚群定义等。

第一层次降维聚类

整合了ΔEx51和WT样本(总共11,222个核)的数据集，使用UMAP可视化细胞簇，根据它们的转录特征识别了14个不同的核簇。

对肌核相关的基因簇（虚线圈起来部分）进行了分析

两个高水平表达Myh亚型的大肌核簇——集群IIx表达高水平的Myh1，编码肌球蛋白重链蛋白IIx (MyHC-IIx)，集群IIb表达高水平的Myh4，编码MyHC-IIb。

NMJ簇——该簇中的肌核表达与神经肌肉连接(NMJ)相关的转录物

MTJ簇——该簇中的肌核选择性表达Col22a1, Col22a1是一种编码胶原家族成员的转录物，该胶原家族成员有助于肌腱连接(MTJ)的稳定，并在收缩期间加强骨骼肌附着

其他单核细胞类型的细胞核簇

SMC簇——含有来自平滑肌细胞的细胞核，如Myh11的表达;

EC簇——包含来自内皮细胞的细胞核，其特征是粘附应激反应蛋白Pecam-1的表达;

FAP簇——包含来自FAP细胞的细胞核，以Pdgfra的表达为特征;

TC簇——包含来自肌腱细胞的细胞核，其特征是表达促进肌腱生成的同型蛋白Mkx

含有巨噬细胞核的簇状MPH——其特征是Adgre1的表达

总共确定了4,748个不同类型骨骼肌核的标记基因，根据已知细胞标记基因的表达和对每一簇核的标记基因的GO分析，指定了每一簇的身份

其他主要分析概述

snRNA-seq分析确定了ΔEx51和WT肌肉中每个簇核的相对丰度

与WT肌相比ΔEx51 TA肌中成熟肌核的百分比总体下降——与WT肌肉相比，ΔEx51肌肉的细胞类型组成不同，主要是由于纤维化、炎症浸润和肌肉再生的增加

snRNA-seq分析揭示DMD肌肉的退行性通路

分析了每个簇的差异表达基因，以便揭示ΔEx51肌肉中不同细胞类型分离的细胞核的异常转录活性。

分析发现与聚类IIa、IIx、IIb和IIx_b相比，聚类NMJ和MTJ中的肌核显示出更多的上调和下调基因

DMD肌再生肌核群体的遗传决定因素分析

在肌纤维受损后，卫星细胞被激活，并可以分化为成肌细胞，通过在损伤部位融合修复受损的肌纤维。在WT和ΔEx51肌肉中，都检测到了MUSC和MYOB核，而我们发现了一个标记为RegMyon的簇，只存在于营养不良的肌肉中

RegMyon簇中的肌核表达Myh3和Myh8，分别编码胚胎和围产期MyHC亚型。Myomaker (Mymk)是再生过程中肌母细胞融合所需的肌肉特异性膜蛋白，也在RegMyon簇的肌核中表达。

为了推断RegMyon、MuSC和Myob集群之间的等级轨迹，对这三个核心种群进行了伪时间轨迹分析，结果显示了从MuSC到Myob(命运B)和RegMyon的有组织的分支进展。Myob集群中的一个基因子集在中心节点转移到第三个分支，该分支由WT和ΔEx51 Myob (fate A)组成，在RegMyon集群中不发育成肌核