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首先给大家介绍一下，各种类型B细胞细胞标志物的表达情况，见下图1，这有助于我们后期对B细胞进行分型。 图1 生发中心B细胞（GCB）、记忆B细胞以及抗体分泌型B细胞的表面标志物[1] 接着给大家介绍一下CD40/CD40L系统。CD40/CD40L系统最早由Banchereau等人于1991年提出，目前已成为B细胞体外扩增和培养最常用的系统。其中，CD40属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族的一员，广泛表达于免疫细胞表面，包括B细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，同时也表达于上皮细胞、内皮细胞、血小板等非免疫细胞表面。CD40的配体CD40L也属于TNF家族，主要表达于活化的T细胞表面，尤其是活化的CD4+T细胞，此外在活化的γδT细胞，NK细胞，血小板等的表面也有表达。CD40/CD40L系统对B细胞的生长发育具有重要作用。有研究报道，它可以促进B细胞的存活和增殖，促进B细胞的分化，诱导B细胞免疫球蛋白类别的转换，抑制B细胞的凋亡。接下来我们就来介绍利用CD40/CD40L系统对人B细胞进行体外扩增培养的方法。一、CD40/CD40L系统用于B细胞体外扩增与培养实验步骤如下[2]： （1）6孔细胞培养板或者10 cm细胞培养皿预先过夜接种表达CD154（CD40LLOW细胞系）的基质细胞，作为B细胞培养的滋养层细胞。（2）将B细胞接种至6孔板（2 mL/孔）或者10 cm培养皿（6 mL /皿）的饲养层细胞上，调整B细胞密度为100/cm2。（3）培养条件：R5培养基（含有5%人血清、55 µM 2-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、10 mM HEPES、1 mM丙酮酸钠和1%MEM非必需氨基酸），并补充重组人IL-2（50 ng/mL）、IL-4（10 ng/mL）、IL-21（10 ng/mL），和BAFF（10 ng/mL），连续培养B细胞8天，培养时间根据实验目的可进行改变。（4）在第4天和第6天，弃去一半旧培养基（避免触碰底部细胞），并用预热的、含细胞因子的新鲜R5培养基等量替换。当培养时间超过8天时，须在第8天将B细胞转移至新的饲养层细胞上，同样在转移后的第4、6天等量替换培养基。（5）细胞培养结束后，收集B细胞进行计数，并在液氮中冷冻保存待用。（6）此外，作者根据初始B细胞增殖动力学的结果，优化了B细胞的接种密度与B细胞培养时间的联系。第0天首次接种的B细胞数分别为1×104、2.5×103和1×103/孔时，可用于B细胞进行为期4、6和8天的培养；8天后，将B细胞加至新的饲养层细胞，此时控制B细胞数分别为4×104、1×104、2.5×103和1×103/孔，可用于B细胞为期10、12、14和16天的培养。注：在该细胞培养体系中，细胞因子以及CD40（B细胞）-CD154（饲养层细胞）的相互作用可以促进初始/记忆B细胞增殖、活化以及APC功能的获得。其中，IL-21可促进B细胞的大量增殖；B细胞激活因子BAFF是TNF家族成员，促进B细胞的存活和成熟，并可促进记忆B细胞向浆细胞分化。IL-4和IL-21则对不同Ig亚型具有调节作用，可根据实验目的选择性添加。
图2 B细胞体外培养细胞分化情况 初始B细胞经该方法进行体外分离培养后，获得激活表型，能够有效促进抗原呈递，并最终可以分化为分泌抗体的浆母细胞和浆细胞。具体表现为：B细胞表面MHC-Ⅱ分子，共刺激分子CD80和CD86表达增加；B细胞表面抗体经历IgM→IgG的转化；记忆B细胞相关的分化标志物CD27表达增加；以及B细胞抗体分泌相关标志物CD138表达增加。 
评价：该方法不仅可用于初始B细胞的分离与体外扩增培养，还能有效促进B细胞增殖和分化，增强B细胞向T细胞呈递抗原促进T细胞激活的功能。二、接着，给大家介绍另一篇关于体外GCB细胞培养的系统，大致过程与方案一类似。实验步骤如下[3]：（1）40LB细胞的处理与辐照（以下为10 cm细胞培养皿的操作步骤）：10 mL 3T3培养基培养40LB细胞，每隔三天传一次代，可以体外持续培养1个月以上。 注：40LB细胞是一种稳定表达CD40L和BAFF的BALB/C 3T3细胞。3T3培养基：高糖型DMEM，补充10% FBS，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。① 40LB细胞从液氮中解冻孵化成功后，以5×106接种至细胞培养皿，大约2天可以长满； ② 弃去培养液，2 mL PBS洗涤细胞后，以胰酶-EDTA溶液消化细胞，室温条件下290 g离心5 min。 ③ 弃上清，加3T3培养基重悬细胞，按下表接种至合适细胞培养板中，让细胞充分贴壁生长。④ 以80 Gy的γ射线照射，抑制40LB细胞的增殖，用作后续的饲养层细胞。（2）小鼠脾脏中B细胞的分离：该步骤和后续从扁桃体中分离B细胞的过程类似，此处不再叙述，详细见下文或者参考文献[3]。 ① 去除饲养层细胞的培养液，加入35 mL含1 ng/mL IL-4的B细胞培养基（RMPI-1640完全培养基，含10% FBS，10 Mm HEPES，1 mM丙酮酸钠，5.5×10-5 M 2-巯基乙醇，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素），加入5 mL细胞悬液至培养皿，细胞接种密度见上表。置于37℃，5% CO2条件下培养4天。② 细胞收集：小心吸去培养皿中细胞培养液，保留约0.5 cm高度的残液，收集至离心管中。培养皿中加入4 mL MACS缓冲液，静置3-5 min至细胞分散，收集该部分缓冲液。再用5 mL MACS缓冲液洗涤培养皿，一并收集。注：MACS缓冲液指的是含0.5% BSA以及2 mM EDTA的PBS溶液。 ③ 细胞离心后弃上清，以10 mL B细胞培养基重悬细胞后进行计数。镜下可以观察到GCB细胞体积明显小于40LB细胞。④ 将B细胞接种至新的饲养层细胞上，根据①中步骤继续培养。 ① 在步骤（3）操作②完成后可进行饲养层细胞去除。② 弃上清，加入260 μL含生物素标记的抗H-2Kd抗体，小心打匀后，置于室温条件下孵育20 min。④ 弃上清，加入50 μL链霉素颗粒以及100 μL MACS缓冲液，小心打匀后，置于室温条件下孵育20 min。⑤ 过柱收集细胞，用合适体积的B细胞培养基重悬细胞后进行计数。 评价：和方法一，该方法也是利用CD40/CD40L系统来对B细胞进行体外扩增培养，但是该方法还介绍了后续饲养层细胞的去除步骤，大家可根据实验目的自行选做。原理：EB病毒是一种DNA病毒，首次于Burkitt淋巴瘤的淋巴母细胞系中发现。EBV具有高度的B细胞倾向性，可结合B细胞表面的CD21受体（即补体C3d片段的受体），同时HLA-Ⅱ可作为其共受体。在体外感染B细胞后能够刺激其持续生长并诱导永生化，从而形成淋巴母细胞样细胞系（LCLs）。病毒转化后的LCLs具有淋巴母细胞和活化B细胞表型：高表达B细胞活化标记物CD23、粘附分子（LFA1、LFA3、ICAM1）以及MHC-I类和II类分子。目前实验中最常用于产生LCLs的EBV菌株来自绒猴细胞系B95-8或者是Burkitt淋巴瘤Akata细胞株。利用EB病毒促进B淋巴细胞的转化实验步骤大致如下[4]：（1）EBV上清制备（根据实验室现有条件，自主选择A或B病毒的制备方式）A：利用B95-8细胞系制备病毒上清： B95-8细胞用RPMI-1640完全培养基（含10%FBS，100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素）培养，当细胞达到指数生长期时，将细胞离心后进行传代培养。用RPMI-1640完全培养基（此时FBS浓度降至2%，B95-8细胞系在低血清浓度的培养基中培养时，会产生大量感染性病毒颗粒）调整细胞密度至2×105/mL，置于37℃，5% CO2条件下连续培养14 天，期间不更换培养基。14天后，收集细胞培养上清，4℃ 1800 rpm离心15 min除去细胞及碎片，用0.22 μm的无菌滤膜过滤，分装成1mL/支，-80℃保存。以该方法制备的EBV上清液不经浓缩可直接用于LCLs生产。B：利用Akata细胞系制备EBV：依据标准细胞培养方案，使用Akata细胞培养Akata细胞。细胞离心后，调整细胞密度至4×106/mL，在培养基中加入浓度为50 μg/mL的抗人IgG抗体（Akata可以通过表面免疫球蛋白交联诱导EBV产生），并在37℃条件下孵育4 h，诱导细胞进入裂解周期。孵育结束后，加入等量的培养基，调整细胞密度至2×106/mL，继续培养5天。5天后，收集细胞培养上清，4℃ 1800 rpm离心15 min除去细胞及碎片，用0.22 μm的无菌滤膜过滤，分装成1mL/支，-80℃保存。以该方法制备的EBV上清液不经浓缩可直接用于LCLs生产，并且病毒滴度高于利用B95-8细胞系制备的EBV滴度。（2）PBMC分离：有关PBMC的分离，我们已在CD107a：免疫细胞活性评价的又一利器——CD107a 流式检测方法与知识大放送一文中进行过详细地介绍。（3）LCLs制备：LCLs的制备也有两种方式可以选择A：将EBV上清液与含10%FBS的RPMI-1640完全培养基以1:2混合，用该混合液将PBMC细胞密度调整至1×106/mL，同时培养液中添加0.1 g/mL的CyA，以1mL/孔接种至24孔板中，置于37℃，5% CO2条件下培养18-24 h后，弃上清，用含10%FBS的RPMI-1640完全培养基重悬细胞，每周半量换液。B：将（2）中的PBMC重新悬浮在3–5 mL 经B95-8制备的上清液或1–2 mL经 Akata制备的的上清液中，控制细胞密度在3-5×106，于37℃条件下培养2 h。离心弃去上清，用含10% FBS的RPMI-1640完全培养基（含0.4 μg/mL的CyA）重悬细胞，控制细胞密度在5×105/mL。以1mL/孔接种至48孔板中，置于37℃，5% CO2条件下培养, 每周半量换液。大约3周后，EBV转化的B细胞开始生长，当细胞生长状态好时，可以将细胞逐渐转移至24孔板，12孔板，以及75 cm2的烧瓶中进行培养。大约5-6周后，LCLs可以稳定并持续生长。注：环孢菌素A（CyA）的加入可以抑制T细胞的活性，提高B细胞的转化率。一方面，如果供血者曾经感染过EBV，那么分离得到的PBMC中会含有部分针对EBV的记忆T细胞，当其被EBV感染的B细胞激活后会对LCLs产生细胞毒作用。CyA浓度可以通过预实验进行摸索。如果是从脐血中分离得到的PBMC通常不用添加CyA，因其缺乏EBV特异性的记忆T细胞。另一方面，CD4+ T细胞也可以通过CD95和CD95配体介导永生化B细胞的凋亡，导致LCLs建立失败。因此需要添加CyA支持B细胞的生长。 四、B细胞的体外培养来源很多，最常见的是分离自外周血和扁桃体，在此我挑选了一篇文章给大家讲讲如何从扁桃体中分离GCB细胞。实验步骤如下[5]：（1）从新鲜采集的人扁桃体中分离出1cm3大小左右的淋巴组织，然后使用无菌手术刀将其切割成3-5 mm的小块，保证无黏膜组织残留。（2）将小组织块置于70 μm的细胞筛中，随后置于10 cm培养皿中，加入10 mL培养基或PBS。使用5 mL注射器柱塞的粗糙端轻轻研磨组织块，通过滤器分离小扁桃体碎片。（3）转移细胞悬液至15 mL离心管中，并用5 mL培养基或PBS冲洗培养皿和细胞筛，一并转移至离心管中，室温条件下400 g离心4分钟。此时沉淀物体积应该在0.5-1 mL左右，并可见大量红细胞。
图4 自扁桃体分离GCB细胞流程示意图 （4）弃上清，用10 mL MACS缓冲液重悬细胞，室温条件下400 g离心4分钟。（5）弃上清，用20 mL MACS缓冲液重悬细胞,。（6）准备两根15 mL离心管，底部加入5 mL淋巴细胞分离液，小心将10 mL细胞悬液加至分离液上方，室温条件下800 g离心20分钟。（7）用移液枪将淋巴细胞层转移到另外一个15 mL离心管中，用13 mL MACS缓冲液重新悬浮细胞，并进行细胞计数。（8）控制每个离心管内细胞的数量在2×108左右，4℃条件下400 g离心4分钟。（该步骤及后续须在4℃条件下进行操作，该步骤结束后注意留出一部分用作流式细胞术细胞纯化前的对照）（9）弃上清，将细胞重悬在800μL的MACS缓冲液中，加入100 μL B细胞去除试剂，以及生物素化的IgD和CD44抗体各1 μL。② 非naive B（包括GCB和记忆B细胞）：不添加CD44抗体。（10）置于冰上孵育25分钟，间歇混匀细胞混合液。（11）加入10 mL MACS缓冲液，4℃条件下400 g离心4分钟。（12）弃上清，加入800 μL MACS缓冲液以及 200 μL抗生物素珠，轻轻混合。（14）加入10 mL MACS缓冲液后，4℃条件下400 g离心4分钟。离心过程中，组装MACS磁力架和LS柱，以3 mL MACS缓冲液预过LS柱，弃流通液。（15）离心结束后，加入1 mL MACS缓冲液重悬细胞，随后加入到LS柱中，以15 mL离心管收集流通液，置于冰上。（16）通过离心（400g，4分钟，4°C）从收集的流通液中分离出细胞，弃上清液，沉淀物中即含有纯化的GCB细胞，用于后续GCB细胞的培养或者GCB细胞纯度的评价。① 步骤8和16中获得的细胞悬液置于4℃条件下400 g离心4分钟；② 用100 μL FACS缓冲液重悬细胞，加入0.1-10 μg/mL的主要标记抗体（CD20、CD19、CD38、CD10），置于4℃条件下孵育30 min。③ FACS缓冲液洗涤细胞一次，随后用200-500μL FACS缓冲液重悬细胞；
图5 纯化前后B细胞的富集情况 本文后续，作者还通过饲养层细胞支持GCB细胞体外扩增培养，以及利用CRISPR-Cas9技术，对GCB细胞基因表达进行操控，进而在体外模拟恶性淋巴瘤中由于常见基因突变导致的B细胞永生化现象，为恶性淋巴瘤的遗传学的研究提供了一种工具。详细的内容大家可以参考文献[5]，这边就不再叙述啦。
图6 利用基因操控技术诱导B细胞的永生化 最后，还有研究表明，Bcl-6基因表达沉默是记忆B细胞形成所必须的。体外过表达Bcl-6可以阻止B细胞向记忆B细胞的分化，感兴趣的读者可以对参考文献[6]详细阅读。1. Helm, M., et al., Isolation of primary human B lymphocytes from tonsils compared to blood as alternative source for ex vivo application. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies In the Biomedical and Life Sciences, 2021. 1179: p. 122853.2. Su, K.-Y., et al., Efficient Culture of Human Naive and Memory B Cells for Use as APCs. Journal of Immunology (Baltimore, Md. : 1950), 2016. 197(10): p. 4163-4176.3. Haniuda, K., T. Nojima, and D. Kitamura, In Vitro-Induced Germinal Center B Cell Culture System. Methods In Molecular Biology (Clifton, N.J.), 2017. 1623: p. 125-133.4. Nagy, N., Establishment of EBV-Infected Lymphoblastoid Cell Lines. Methods In Molecular Biology (Clifton, N.J.), 2017. 1532: p. 57-64.5. Caeser, R., et al.,Genetic manipulation and immortalized culture of ex vivo primary human germinal center B cells. Nature Protocols, 2021. 16(5): p. 2499-2519.6. Kuo, T.C., et al., Repression of BCL-6 is required for the formation of human memory B cells in vitro. The Journal of Experimental Medicine, 2007. 204(4): p. 819-830
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