【原】【LorMe周刊】噬菌体新应用：基于靶向核酸内切酶介导荧光生物传感器的病原菌检测

作者：平翎，南京农业大学在读硕士，主要研究堆肥中耐药菌的噬菌体消减。 

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍基于靶向核酸内切酶介导荧光生物传感器的病原菌检测技术，原文于2024年发表在《Journal of Hazardous Materials》上。

导读

为了预防食源性疾病爆发，精确识别活性病原体具有至关重要的意义。本研究将机器视觉和学习与单个微球相结合，开发了一种噬菌体与丁酸梭菌靶向核酸内切酶（CbAgo）介导的荧光生物传感器，无需复杂的DNA提取和扩增程序即可检测活性沙门氏菌（S. typhimurium）。噬菌体和裂解缓冲液分别用于捕获和裂解活性沙门氏菌。随后，CbAgo可以剪切细菌DNA以获得目标DNA，该DNA指导新的靶向荧光探针的切割，产生的荧光信号积累在修饰了链霉亲和素的单个微球上。整个检测过程由机器视觉和学习算法进行分析和解释，实现了对沙门氏菌的高灵敏度检测，检测限为40.5 CFU/mL，线性范围为50–107CFU/mL。这种生物传感器具有卓越的灵敏度和选择性，为快速有效地检测食源性病原体提供了一种有前景的方法。

主要结果

1.AFPAM生物传感器对沙门氏菌检测的主要证据

机器视觉-学习辅助的噬菌体与CbAgo介导的荧光生物传感器检测活性沙门氏菌的机制如方案1所示。首先，羧酸磁性纳米颗粒（MNPs）被噬菌体功能化为具有特异性结合活性沙门氏菌亲和力的MNP-噬菌体共轭物，可以快速将其与食品基质分离。然后，采用RIPA裂解缓冲液直接裂解活性沙门氏菌细胞，释放其DNA。基于沙门氏菌基因序列，作者设计了三种互补的gDNA（gDNA1、gDNA2和gDNA3），每种含有16个碱基，可以增强CbAgo对目标DNA的切割效率。CbAgo切割沙门氏菌双链DNA碱基之间的磷酸二酯键，获得一个16个碱基的tDNA，该tDNA出现在gDNA的5'磷酸端的互补单链DNA链上。随后，tDNA结合到CbAgo上，作为引导DNA，激活了该反应系统中荧光信号探针的第二轮定向切割，即6-FAM(Bio)-ssDNA-BHQ1（简称为BFQ-ssDNA）中的单链DNA（图1A）。由于BHQ1猝灭基团的去除，生物素化的羧基荧光素[6-FAM（Bio）]在激发时发出荧光。

CbAgo蛋白的精确靶向切割活性是该反应成功的关键因素。作者通过检测沙门氏菌双链DNA、gDNA、CbAgo和BFQ-ssDNA混合物中荧光强度的变化来验证这种靶向切割活性。结果显示，荧光探针被CbAgo切割，只有当这些探针同时存在时才会产生特异的荧光信号。此外，当反应持续40分钟时，荧光信号值达到峰值并稳定下来。在没有CbAgo、tDNA或gDNA的情况下，尽管混合物的荧光信号增加了，但远远低于同时存在这三者的混合物的荧光信号，这表明CbAgo具有靶向切割活性（图1B）。丙烯酰胺凝胶电泳的结果显示，在gDNA4的指导下，CbAgo可以在gDNA4的5'磷酸末端的第10到第11碱基处定向切割ssDNA2，产生含有35和24碱基的两条带（图1C和1D）。相比之下，在没有CbAgo或gDNA4的情况下，未观察到相应的两条带（图1D）。

方案1 AFPAM生物传感器机制示意图

2.AFPAM生物传感器特性

作者制备了具有不同粒径的MNP-phage结合物，以研究它们对沙门氏菌的捕获率。当暴露在磁场中时，含有更多Fe3O4大颗粒的MNP可以在几秒内从非磁性食物底物中分离出来。结果表明， MNP1000-phage结合物表现出最高的捕获率，因此选择它用于后续实验。噬菌斑的存在证实了噬菌体成功结合到MNPs的表面。如果没有噬菌体偶联物，所制备的MNP1000-phage偶联物将不会产生相应的斑块。此外，实验使用动态光散射（DLS）来表征在噬菌体结合到MNP1000表面前后的颗粒大小和电位的变化。结合后，MNP1000的粒径和电位都有所增加。这些结果也证实了噬菌体已成功结合到MNP上。在MNP1000-phage特异性捕获到活性沙门氏菌后，RIPA裂解缓冲液可以直接裂解沙门氏菌并释放其dsDNA。通过琼脂糖电泳确认了dsDNA的释放，在沙门氏菌经历RIPA裂解缓冲液裂解后出现了明亮的条带，而仅使用RIPA裂解缓冲液或仅存在沙门氏菌时则没有出现条带。扫描电子显微镜（SEM）确认了MNP1000-phage成功捕获了沙门氏菌。如图1H和1I所示，单个MNP1000呈规则的球形颗粒，单个沙门氏菌细菌呈杆状。图1J说明了MNP1000-phage成功捕获了沙门氏菌。此外，只含有活性沙门氏菌的培养皿显示出噬菌斑，而经过高温高压处理的无活性沙门氏菌培养皿则没有显示出噬菌斑。这意味着噬菌体只能在活性细菌内繁殖，随后裂解。

图1 CbAgo靶向切割特性验证图以及AFPAM生物传感器中纳米粒子的表征

3.AFPAM生物传感器对沙门氏菌的检测灵敏度

在优化条件下，作者评估了AFPAM生物传感器在检测不同沙门氏菌浓度方面的灵敏度。如图2A所示，由于生物素-亲和素相互作用的特异性，由CbAgo裂解的6-FAM(Bio)-ssDNA会在单个PS0.5 mm-SA微球的表面积聚。这个微球作为荧光信号富集载体，在倒置荧光显微镜下成像时，可以观察到一个绿色的荧光球。随着沙门氏菌浓度逐渐增加，荧光微球的亮度也逐渐增强（图2B）。为了使微球亮度增加更加明显，使用不同的颜色来表示不同的荧光强度。检测限（LOD）确定为40.5 CFU/mL（LOD = 3 S/N，S = 0.54，N = 0.04，其中S表示所有空白样品对应的平均荧光强度的标准偏差，N表示所有样品的平均荧光强度曲线在低浓度范围内的线性斜率）（图2C）。与传统的线性回归相比，基于机器学习的弹性网络回归模型在沙门氏菌浓度和荧光微球图像的平均荧光强度之间具有更好的线性相关系数（图2C），表明该模型更精确，更适用于检测实际样品中的沙门氏菌。

该研究还采用了qPCR作为对照方法来评估AFPAM生物传感器的分析性能。结果如图2F和2G所示，随着沙门氏菌浓度的增加，循环阈值（Ct值）减少。qPCR用于沙门氏菌检测的线性范围为102-107 CFU/mL。这些结果验证了噬菌体和CbAgo介导的AFPAM生物传感器具有与qPCR相同的线性和敏感性量级。不同之处在于，AFPAM生物传感器绕过了qPCR中存在的繁琐的DNA提取和细菌DNA放大步骤。此外，噬菌体可以区分活细菌和非活细菌，以防止假阳性的PCR结果（图2H）。

图2 AFPAM生物传感器的分析性能图

4.AFPAM生物传感器对沙门氏菌的检测特异性

高特异性是提高AFPAM生物传感器的有效性的重要因素。该研究使用了李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和副溶血弧菌来测试AFPAM生物传感器在检测沙门氏菌时的特异性。首先，由于噬菌体的生物学特性，在AFPAM生物传感器中使用的噬菌体LPST10具有高度宿主特异性。噬菌体在宿主细菌体内的完整生命周期需要与活性宿主细菌互作。在胰蛋白酶大豆琼脂平板表面出现的透明、小型、圆形斑点就是因噬菌体感染宿主细菌细胞、在其内繁殖并溶解导致宿主细菌死亡而形成的噬菌斑。然而，在李斯特菌、金黄色葡萄球菌和其他致病菌的细胞培养基中未出现任何噬菌斑，这证明了噬菌体LPST10能够特异性地识别沙门氏菌。此外，我们评估了AFPAM生物传感器对不同致病菌DNA的荧光响应。结果显示，只有沙门氏菌DNA和含有沙门氏菌的DNA混合物产生了明显的荧光信号，而其他致病菌的dsDNA产生的荧光信号与空白对照相似，表明AFPAM生物传感器具有很高的选择性。这是因为只有沙门氏菌基因序列能够被特定引物（gDNA）识别，从而引导CbAgo的靶向切割。因此，噬菌体对活性沙门氏菌的识别能力和特异引物与靶标匹配的结合能力为AFPAM生物传感器提供了两级特异性，确保了对目标细菌的选择性识别。

5.AFPAM生物传感器对沙门氏菌检测的实际样本分析

为评估AFPAM生物传感器在复杂食品样品中检测沙门氏菌的可行性，向无沙门氏菌的鸡肉样品中添加不同浓度的沙门氏菌来评估其回收率。结果表明AFPAM生物传感器可以准确可靠地检测食品样品中的沙门氏菌。然后，通过使用AFPAM生物传感器测试从武汉市（中国湖北）各个市场收集的几个真实食品盲样（生菜、五花肉、鱼、鸡腿、牛奶、橙汁样品）验证了其在实际应用中的可行性，将AFPAM生物传感器的结果与传统的平板计数和标准qPCR方法进行了比较，使用无病原菌的无菌食品样品作为空白对照。作者建立的基于机器学习的弹性网络回归模型使用了13组不同浓度的沙门氏菌荧光微球图像数据，建立了沙门氏菌浓度与平均荧光强度之间的关系，具有足够的稳健性和普适性。

如图3E所示，通过AFPAM生物传感器、传统培养法和标准qPCR方法对8个样品进行了沙门氏菌阳性检测，而其余样品则为阴性。相关拟合结果显示，使用AFPAM生物传感器检测沙门氏菌的结果与传统培养法和标准qPCR方法的定量检测结果良好一致。此外，作者还测试了从中国武汉华中农业大学采集的自来水和地表水样品，结果表明AFPAM生物传感器可用于环境中沙门氏菌的检测。值得注意的是，AFPAM生物传感器仅用三小时就可以实现对沙门氏菌的定量检测，其准确性与需要40-48小时才能获得准确结果的平板计数法相当。尽管qPCR方法是检测病原菌的金标准，但它需要复杂的DNA提取和多步DNA扩增才能实现高灵敏度和高通量的沙门氏菌检测（定量限为100 CFU/mL）。相比之下，AFPAM生物传感器结合了噬菌体和RIPA裂解缓冲液的特性，绕过了复杂的DNA提取步骤和多种仪器的使用。此外，AFPAM生物传感器定量限比qPCR低2倍（定量限为50 CFU/mL）。总之，AFPAM生物传感器为复杂食品样品中活性沙门氏菌的快速、简便和敏感检测提供了一个强大的平台，无需复杂的仪器设备或复杂的DNA提取和扩增步骤。然而，AFPAM传感器确实存在一定的局限性。其方法需要对检测结果进行成像和后续图像处理，以预测沙门氏菌的浓度，因此可能不适合于高通量的沙门氏菌检测。

图3 使用AFPAM生物传感器、平板计数方法和标准qPCR方法对沙门氏菌进行特异性和真实样本分析

总结

作者创新了一种机器视觉-学习介导的、基于噬菌体和CbAgo的AFPAM生物传感器，无需复杂的DNA提取和扩增步骤就可以快速、简便和高灵敏度地检测沙门氏菌。由于其高灵敏度和无DNA扩增设计，所提出的AFPAM生物传感器已成功在食品和环境样品中实现了沙门氏菌的准确和高灵敏度定量检测。然而，目前AFPAM生物传感器尚无法进行沙门氏菌的高通量检测。在未来的研究中，通过整合微流体系统、便携式荧光显微镜或手机摄像头系统，希望开发出极其敏感、高通量、用户友好的传感方法，适用于现场检测，这将有助于更好地检测和控制食源性病原体污染。

论文信息

原名：A machine vision-assisted Argonaute-mediated fluorescence biosensor for the detection of viable Salmonella in food without convoluted DNA extraction and amplification procedures

译名：一种机器视觉辅助的靶向核酸内切酶介导荧光生物传感器，用于检测食品中活的沙门氏菌，而无需进行复杂的DNA提取和扩增程序

期刊：Journal of Hazardous Materials

DOI：10.1016/j.jhazmat.2024.133648

发表时间：2024-1-30

通讯作者：Yiping Chen

通讯作者单位：华中农业大学食品科技学院