无菌工艺环境的微生物控制和监测

东营菌物科学 2024-03-25 发布于山东

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在制药行业中，微生物受控环境被用于实现各种生产目的。USP1116中提供了通过无菌工艺进行环境中微生物污染风险控制的相关信息和建议。在这种环境中生产的产品包括无菌制剂、无菌原料药、无菌中间体、辅料和部分医疗器械。USP1116中给出的指南和微生物评估的监测参数仅适用于洁净室、限制进入隔离系统（RABS）和用于无菌工艺的隔离器。很大一部分无菌产品是通过无菌工艺生产的，而不是通过终端灭菌实现无菌。

“aseptic”和“sterile”的含义差别

“sterile”是指没有活的微生物或有繁殖潜力的生物体。而在现代无菌产品的生产中，“aseptic”描述了在受控环境中处理无菌材料的过程，该过程旨在将微生物污染保持在已知风险最小的水平。

由于无菌工艺依赖于将微生物从工艺流程中排除，并在加工过程中防止微生物进入敞开的容器，因此除了产品的微生物负载外，加工环境的微生物负载是控制不可接受的微生物污染风险的重要因素。

在任何有人员操作的环境中，一定程度的微生物污染都是不可避免的。因此，期望在每次无菌工艺操作期间，在所有位置实现零污染在技术上是不可能的，也是不现实的。尽管生产者应该经常审查环境监测的结果，以确保设施在经过验证的控制状态下运行，但由于监测方法的局限性，监测结果实际上既不能证明也不能证伪（受控环境的完全）无菌性。对制造环境相关的风险评估必须长期进行，在对实际调查结果进行审查的基础上制定污染回收率指标，当设施内达到最佳运行条件时，污染回收率水平通常在正常的变化范围内变得相对稳定。

高级无菌技术和洁净室级别

高级无菌技术可以被定义为在生产过程中不依赖人为操作直接干预的无菌技术。现在，隔离器技术、吹灌封一体技术和封闭的限制进入隔离系统（RABS）（仅在设置和操作时打开）可以被认为高级无菌技术。这些技术在生产过程中，不允许更衣人员进行直接干预。近年来，隔离器技术在制药行业得到了广泛的认可。隔离器和封闭的限制进入隔离系统（RABS）有效地将操作者和关键无菌生产环境隔离开来。因为这些系统大大地降低了污染的风险，所以它们的微生物控制水平比传统的同等洁净度级别的洁净室微生物控制水平高，如ISO5级（B级）。

ISO14644系列阐述了洁净室和环境控制区的设计和建造。这个标准用单位体积的总粒子浓度表示洁净环境的性能。ISO14644-1规定了不同空气质量级别的洁净环境允许的总粒子数。大家可以据此来考虑设计参数和建立洁净环境。洁净室环境监测由总微粒数部分和微生物数部分组成这种做法是比较常见的，也是比较合适的。表1给出了制药企业常见的洁净室等级。在无菌生产工艺中，一般会用到ISO14644-1中的5-8级。

微生物评价程序

在环境控制中的重要性

因为注射剂产品对可见异物、不溶性微粒和无菌的要求，受控环境中对非活性的微粒和微生物的监测都是重要的控制参数。由于空气中的微生物通常附着在10-20µm的颗粒上，仅对受控环境中的总颗粒物计数（包括使用连续监测设备）并不能提供有关微生物含量的信息。依据制药行业的现有数据，尚无法在总颗粒物和可存活微生物的浓度之间的建立严谨的量值换算关系。被普遍认可的是如果在运行的洁净室或其他受控环境中存在的颗粒物越少，那么在气流、温度和湿度没有变化的情况下，空气中微生物存在的可能性就越小。

微生物监测计划的目标是获得环境微生物负载的代表性估计值。

受控环境的微生物监测程序应当评估可能对环境微生物负载产生影响的人员的清洁和消毒程序的有效性。对微生物的监测应能够提供足够的信息以确定受控环境在适当的控制状态下运行。

在适当的情况下，对洁净室和其他一些受控环境的微生物监测应包括对室内空气、进入关键区域的压缩空气、表面、设备、消毒容器、地板、墙壁和人员服装（如衣服和手套等）的微生物含量进行定量。

为了保证收集到有意义的数据，对环境微生物的取样应当由授权人员在正常操作期间进行。虽然审查（当次）监测结果的符合性很重要，但是审查长期结果以确定是否存在趋势也很重要。趋势可以通过构建包括警戒线和行动限的统计控制图来可视化。受控环境的微生物控制情况的评估可以部分基于这些趋势数据来完成，并应当定期发布报告或总结来提醒相关责任人。

污染控制效果的

实际评估和人员培训

洁净环境应当按照ISO14644系列中的规定进行验收，以满足其设计分类要求。洁净室的设计、施工和运行差异很大，因此很难概括如过滤器完整性、空气流速、气流模式、换气次数和压差等参数的要求，在特别关键的应用中如无菌工艺过程，采用实际的风险评估是比较合适的。

有一个L-R方法，通过评价气流以及当前环境稀释和清除悬浮粒子的能力来挑战通风系统。使用烟雾发生器使分析员能够目视洁净室或控制环境中所有区域的空气运动，包括涡流和湍流区域，并可以对气流模式可以进行调整以使不期望的影响降到最低。

在有人员和设备存在的正在运行的洁净室中完全消除湍流是不可能的。对气流的可视化评估只是优化洁净室性能的努力中的一步，并不是确切的通过失败测试，因为可接受和不可接受的条件还不明确。

良好的人员操作在污染控制过程中发挥着不可或缺的作用，合适的培训和监督是污染控制的核心，无菌生产的关键活动取决于微生物受控的环境，生产者要努力注意并细化与之有关的所有环节。严明的纪律和对人员严格的监督是保证环境质量适用于无菌工艺的必要要求。对在控制环境中工作的所以人员的培训是很关键的，尤其在高度自动化的操作过程中，监测人员应该是最直接接触操作区域内的关键区域和表明的人员。微生物取样时，不恰当的取样技术或人员进入接近关键区域都可能带了微生物污染。

设备管理应必须保证所有在洁净室和高级无菌工艺环境操作的人员都要非常熟悉微生物实验相关的准则。培训应包括，对无菌技术基本原理的说明，还有生产的相关程序和产生污染的潜在原因的处理程序之间的关系。进行监督、审计和检查微生物控制与检测活动的人员必须熟知微生物学的基本原理、微生物的生理特征、卫生与消毒、培养基选择与制备、分类系统级灭菌知识。

不能忽略良好的个人卫生和对关注无菌更衣过程细节的重要性。根据控制环境级别和系统本身标准的不同，更衣程序也有所不同。无菌工艺环境要求无菌服必须具有最好的滤过性能。要求尽可能全地覆盖住皮肤，袖口或带子，在关键的手套-袖子连接处应尽可能少地露出。在传统的洁净室中，在任何条件下都不能看见暴露的皮肤。环境监测计划本身并不能检测到无菌生产过程中的破坏环境微生物质量的所有事件，因此必须进行周期性的培养基灌装实验或无菌工艺模拟研究，以进行全面的持续不断地监督，确保操作控制和培训效果的维持。

微生物环境监测计划的

设计和执行中的关键因素

1.培养基和培养条件的选择

例如在环境监测中，细菌通常使用的培养基是胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）,真菌通常使用的培养基是沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）；对于水系统微生物的试验，使用R2A，这是一种用于培养异养微生物的低营养琼脂。还有其他培养基如大豆酪蛋白消化培养基（SCDM），因为能使细菌、酵母菌和霉菌生长，适合大多数条件下的环境监测，可以在这些培养基中加入添加剂使之克服或减少消毒剂或抗生素的影响。生产者应该关注霉菌和酵母菌的检测，如有必要，可以使用沙氏、改良沙氏或抑制霉菌琼脂等普通的真菌培养基。

在无菌工艺中可能观察到微需氧菌，应能保证微需氧菌和生物体的监测在低氧条件下的生长。每种用于环境监测的培养基，包括用于回收特定类型微生物的培养基必须进行促生长能力的评价。

一旦已选择了合适的培养基，则要选定合适的培养时间和温度。一般设施环境中常见的嗜温细菌和霉菌可以在较宽的温度范围内生长。对于大多数嗜温微生物来说，在超过约20℃的温度范围下回收是可能的。在缺乏确凿依据的情况下，可能会将一个平皿在较低和较高温度下分别进行培养。很重要的一点是在较低温度下培养可能会影响革兰氏阳性球菌的回收，这些菌通常与人员相关。应验证用于制备生长培养基的灭菌过程。在可能的情况下，培养基及其包装应通过湿热灭菌、辐照或其他合适的方式进行最终灭菌。

2.采样计划和采样点的选择和评估

在洁净室或其他受控环境初次启动或试运行期间，应确定空气和表面取样的具体位置。需要考虑的采样点主要包括暴露的产品、容器、封盖和产品接触表面等。在无菌工艺中，容器、封盖和产品暴露的区域通常被称为关键区域，关键区域始终为ISO5级。在无菌操作中，整个关键区域应视为无菌区域。非无菌对象（包括洁净室操作人员戴手套的手或隔离器/RABS中的手套）在无菌操作前或无菌操作中都不能和灭菌产品、容器封口、灌装台或传送装置直接接触。操作人员和环境监测人员都不能触摸传送装置、灌装针头、组装加料斗或其他任何一个产品输送过程中的设备。这意味着最好在生产操作结束时再对这些表面进行表面监测采样。

采样频率取决于在该环境中进行的生产过程。仅用于提供一个微生物负载较低环境的非无菌产品生产区，环境监测频率可相对较低。进行封闭式生产操作的环境，包括发酵、无菌API工艺和化学操作，因为周围环境的微生物污染风险相对较低，采样点和监测频率也可以相应减少。在终端灭菌灌装操作中，微生物的监测主要取决于产品的易感性以及微生物存活和增殖的可能性。对随后的灭菌过程具有抗性的微生物的识别和数量估计可能比对周围生产环境的微生物监测更为关键。

洁净室的级别有助于确立微生物的控制水平，但并不意味着在同一级别下的所有房间应具有相同的控制水平和监测频率。可以采用合适的风险评估技术来制定科学有效的污染控制计划，使得监测能够反应生产加工活动的微生物控制要求。

表 2 按照频率递减的顺序给出了与采样区域的关键性或被采样产品的风险相关的建议采样频率。环境监测计划的采样频率应是灵活的，采样点应根据观测到污染数和持续的风险分析进行调整。在长期观察的基础上，生产者可以增加或减少甚至完全取消相应的采样点，过度采样可能与过少采样一样不利于污染控制。

合适的采样点选择应评价区域内的人员活动和操作的影响，尤其是在关键区域内的干预和操作。最可能的污染路线是空气携带，因此，在风险评估中，与暴露的灭菌物料附近的空气携带污染有关的样品是最关键的。其他需要考虑别的位置是设备和物料从较低级别向较高级别的传递点、门和气锁的周围及内部的监测等。对墙壁、地面的采样可以提供消毒计划的有效性信息。

对关键区域内的表面监测通常在操作结束时进行，同时应当避免培养基和湿拭子上的稀释液在表面上残留，因为它们可能导致微生物繁殖。

3.洁净室、隔离器和RABS的微生物控制参数

自从20世纪80年代早期，生产者们便在环境监测中确立了警戒线和行动限。近年来，警戒线和行动限之间的数值差异已经变得很小，尤其是在ISO5级环境下。微生物测试中的生长和回收率通常在±0.5个对数值之间小幅变动。对微生物空气采样设备的研究显示，在常用的采样设备中，结果的变异性可能高达十倍。由于这种固有的可变性和不确定的采样误差，设定的如警戒线为1cfu和行动限为3cfu，两者之间的假定差异，在分析上并不显著。因此，将可预期的正常范围内的波动视为规定数值上的差异，是不科学的，可能会导致不必要的行动。

由于微生物生长和回收率测试中准确性和精密度测定的局限性，分析人员对污染风险的判断可以综合考虑依据检测到污染的频率，而不是以任何单个样品中检测到的CFU数。在一个取样期间内，在同一环境中的多个地点观察到污染可能表明产品污染风险增加，应仔细评估。

应确定每个洁净室环境的平均污染回收率，给定场所/房间内污染回收率的变化可能表明需要采取纠正措施。在ISO5关键区域内，基于当前采用的方法，空气和表面的污染回收率应≤1%。根据已公布的数据，封闭式RABS和隔离器系统的污染回收率明显更低，预计＜0.1%。表面样品也可以从洁净室服装上提取，这些采样点的(污染率)平均值也应该＜1%，而在封闭式RABS和隔离器上的手套，应满足＜0.1%的污染回收率。

表3列出了无菌环境初始污染回收率的建议值。污染回收率是指环境样品发现微生物污染的比率。当污染回收率趋势在持续一段时间内高于推荐值，应该采取一定的行动。