Acta Pharm Sin B（IF=14.5）：齐墩果酸变构激活SHP2抑制STAT3-Th17轴改善结肠炎

克罗恩病是一种主要影响胃肠道的慢性炎症性疾病，其特点是炎症遍及受影响肠壁的整个厚度，从而导致形成深部且疼痛的溃疡，其治疗旨在控制炎症、缓解症状并改善患者的生活质量。含有Src同源2结构域的酪氨酸磷酸酶2（SHP2）是一种非受体酪氨酸磷酸酶，在细胞信号传导中发挥着至关重要的作用，与炎症密切相关，先前的研究表明SHP2对炎症具有负调节作用。这些发现表明SHP2是一个有前途的抗炎靶点，SHP2激活剂的鉴定有助于开发一种新的抗炎治疗策略。齐墩果酸是一种天然三萜类化合物，属于五环三萜类。它广泛存在于各种植物来源中，包括橄榄油和大蒜，以及某些药草，例如橄榄、山楂和女贞。作为一种生物活性化合物，齐墩果酸因其多样化且有前景的药用特性而受到研究人员和制药行业的广泛关注。它还表现出有效的抗炎、抗氧化和保肝作用。然而，齐墩果酸抗炎作用的机制仍然未知，需要进一步研究。

2024年3月18日，南京大学郭文洁、孙洋、刘雯，联合南京医科大学邹建军团队在Acta Pharmaceutica Sinica B（IF：14.5）发表了题为“Allosterically activating SHP2 by oleanolic acid inhibits STAT3–Th17 axis for ameliorating colitis”的文章，发现齐墩果酸有效减轻小鼠结肠炎，机制上，齐墩果酸通过与SHP2的PTP结构域活性中心的R362、K364和K366结合，维持SHP2的活性开放状态，从而促进SHP2与其底物之间的结合。激活的SHP2通过干扰STAT3和IL-6Rα之间的相互作用并抑制STAT3 的激活来阻碍Th17分化。通过敲除SHP2或施用SHP2抑制剂SHP099可以消除这种保护作用。这些发现强调了齐墩果酸作为治疗炎症性肠病的有前途的治疗剂的潜力。

研究结果

1、齐墩果酸直接与激活的SHP2 结合并防止其被SHP099 失活

为了鉴定可以维持其开放构象的SHP2磷酸酶激活剂，作者使用SHP2-E76K (1–525)（SHP2 的活性开放态突变体）进行了两步筛选测定。采用蛋白质热位移技术进行初步筛选，获得稳定SHP2-E76K的化合物。使用体外磷酸酶测定检测目标化合物对SHP2 抑制剂SHP099 IC 50的影响以进行二次筛选。在SHP099 IC 50测定的初步筛选中，从1900个FDA批准的14个候选化合物和30个我们自己的SE系列化合物中选出了14个候选化合物，齐墩果酸表现出最好的效果。随后蛋白质热稳定性分析以验证了齐墩果酸稳定了SHP2-E76K的构象，MST实验表明与SHP2-WT相比，齐墩果酸对结合活化的SHP2（SHP2-E76K）具有更高的亲和力。此外，齐墩果酸显著增加SHP2的胞内磷酸酶活性（图1A-G）。

为了确定齐墩果酸和SHP2的主要结合位点，研究进行了LiP-MS实验，发现齐墩果酸的结合阻止了蛋白酶K的裂解，齐墩果酸处理下出现一个长肽，并减少两个短肽，这表明齐墩果酸可能与长肽结合并保护其免受蛋白酶K消化。基于LiP-MS结果，利用大分子对接预测了SHP2与齐墩果酸的结合模型，并利用PyMol将齐墩果酸与SHP2的PTP结构域之间的相互作用可视化，结果显示齐墩果酸与激活的SHP2活性中心的氨基酸残基R362、K364和K366结合，占据N-SH2和PTP结构域之间的界面，从而导致自抑制状态被破坏并持续激活，当R362被谷氨酸取代时，SHP2与齐墩果酸的结合亲和力显著降低（图1H-N）。

图1 齐墩果酸直接与激活的 SHP2 结合并防止其被 SHP099 失活

2、齐墩果酸抑制STAT3磷酸化和Th17分化

根据细胞分化和功能特性，Th1和Th17细胞是两个主要的促炎亚群，因为它们分别分泌IFN-γ和 IL-17。既往研究表明，Th1和Th17细胞参与并加重了炎症性肠病的发生。IFN-γ/STAT1和IL-6/STAT3通路对于Th1和Th17 T细胞分化很重要。因此，研究选择T细胞作为齐墩果酸的靶细胞，考察齐墩果酸对这些途径和T细胞分化的影响，发现齐墩果酸增加T细胞中SHP2的细胞内磷酸酶活性。IL-6刺激导致STAT3激活，而齐墩果酸预处理以剂量依赖性方式抑制STAT3激活。此外，流式细胞术发现齐墩果酸显著抑制Th17细胞的分化。因此，齐墩果酸可能通过激活酪氨酸磷酸酶SHP2并导致STAT3去磷酸化来抑制Th17细胞的分化（图2）。

图2 齐墩果酸选择性抑制STAT3的磷酸化和Th17的分化

3、齐墩果酸诱导SHP2和STAT3之间的相互作用阻止IL-6/STAT3信号转导过程中STAT3向IL-6R的募集

接下来，作者检查了OA诱导的SHP2激活和STAT3介导的信号传导之间的关联。免疫共沉淀实验发现齐墩果酸处理阻止了STAT3被募集到IL-6Rα受体上，并且p-STAT3的水平同时下降。此外，SHP099预处理消除了齐墩果酸对p-STAT3水平的抑制作用，SHP099逆转了齐墩果酸诱导的STAT3募集至IL-6R的抑制。免疫荧光分析证实齐墩果酸可阻断STAT3向细胞核的转移。这些数据表明齐墩果酸诱导的p-SHP2会隔离STAT3的激活，从而选择性地调节STAT3信号传导（图3）。

图3 齐墩果酸诱导SHP2和STAT3之间的相互作用阻止IL-6/STAT3信号转导过程中STAT3向IL-6R的募集

4、齐墩果酸改善TNBS 诱导的小鼠实验性结肠炎SHP抑制剂逆转了齐墩果酸对结肠炎的改善作用

鉴于齐墩果酸对IL-6诱导的STAT3激活和Th17分化的抑制作用，研究采用TNBS诱导的实验性结肠炎小鼠模型来评估其抗炎能力。发现齐墩果酸治疗显著逆转体重减轻，显著减轻结肠损伤，抑制了Th17分化，改善结肠上皮损伤，恢复了TNBS破坏的粘附连接的完整性，减少CD4+T细胞的浸润。总的来说，这些发现表明齐墩果酸可以有效缓解TNBS诱导的小鼠实验性结肠炎（图4）。

图4 齐墩果酸改善 TNBS 诱导的小鼠实验性结肠炎

为了验证齐墩果酸对TNBS诱导的结肠炎的改善依赖于SHP2，检查了齐墩果酸与SHP2的特异性变构抑制剂SHP099联合对TNBS诱导的结肠炎的作用，发现SHP099消除了齐墩果酸对TNBS诱导的结肠炎的改善作用，从而表明TNBS诱导的实验性结肠炎的改善作用齐墩果酸对小鼠的影响依赖于SHP2，进一步使用组织学分析、免疫组织化学和免疫荧光检查结肠组织的宏观损伤、粘附连接的完整性和CD4 + T细胞的浸润，均支持齐墩果酸依赖 SHP2来改善结肠炎（图5）。

图5 SHP抑制剂逆转了齐墩果酸对结肠炎的改善作用

5、T细胞中的SHP2敲除加剧了TNBS诱导的结肠炎、促进体内Th1和Th17分化、消除了齐墩果酸对结肠炎的改善作用

CD4 + T细胞中SHP2敲除加剧了TNBS诱导的结肠炎症反应，TNBS攻击后SHP2 CD4–/–小鼠结肠组织中的促炎细胞因子水平比WT小鼠结肠组织中的促炎细胞因子水平增加更显著，且SHP2 CD4–/–小鼠的结肠标本中隐窝和杯状细胞的丢失、单核细胞的浸润和粘膜损伤相对严重。这些结果表明，CD4 + T 细胞中的 SHP2 敲除会促进促炎细胞因子的产生，从而加重TNBS诱导的结肠炎（图6）。

图6 T细胞中的SHP2敲除加剧了TNBS诱导的结肠炎

CD4 + T细胞的分化在调节炎症反应中起着至关重要的作用。为了评估SHP2敲除对 CD4 + T 细胞分化的影响，进行了流式细胞术和蛋白质印迹。结果表明，CD4 + T 细胞中的SHP2敲除导致Th1和Th17分化增加，并提高细胞内p-STAT1和p-STAT3的水平。这些发现表明，SHP2 通过抑制Th1和Th17分化而发挥炎症反应负调节因子的作用（图7）。

图7 SHP2敲除促进体内Th1和Th17分化

为了进一步证实齐墩果酸对TNBS诱导的结肠炎的有益作用取决于SHP2，在SHP2 CD4–/–小鼠中检查了齐墩果酸对TNBS诱导的结肠炎的作用。结果发现齐墩果酸对TNBS诱导的结肠炎的改善作用在SHP2 CD4–/–小鼠中被消除。此外，齐墩果酸未能改善用TNBS治疗的SHP2 CD4–/–小鼠的结肠通透性，齐墩果酸治疗无法逆转CD4 + T细胞中的SHP2敲除促进的Th17分化，对结肠组织宏观损伤、粘附连接完整性和 CD4 + T 细胞浸润的分析进一步支持了这一发现（图8）。

图8 SHP2敲除消除了齐墩果酸对结肠炎的改善作用

总结

该研究旨在鉴定一种新型SHP2激活剂并评估其抗炎活性。研究结果表明，齐墩果酸直接与激活的SHP2的PTP 活性中心的裂口结合，保留其开放构象，从而保护SHP2免于失活，这导致进一步抑制STAT3磷酸化和Th17分化来抑制炎症反应，从而有效缓解小鼠结肠炎。这些发现将齐墩果酸被确定为SHP2的独特激活剂，强调了齐墩果酸作为治疗Th17相关疾病的有前途的治疗剂的潜力。

图9 齐墩果酸减轻小鼠结肠炎的靶点及相关机制