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结果： 作者首先从注射血管紧张素II（Ang II）的C57BL/6小鼠中分离出心脏非心肌细胞，进行单细胞RNA测序（scRNA测序）实验（图1A）。利用标记基因表达进行UMAP降维分析，确定了细胞簇。作者发现了9个簇，包括成纤维细胞、肌成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞（EC）、T和NK细胞、B细胞、平滑肌细胞（SMC）、心肌细胞（CM）和一个小的未知簇（X）（图1B，补充图 1A ）。为了研究巨噬细胞在高血压引起的心脏功能障碍中的作用，作者进一步将表达CD68、Adgre1、Fcgr1和Csf1r的巨噬细胞聚类为15个小的亚群（图1C，补充图 1B - 1C ）。这些亚群可以定义为2种巨噬细胞类型：循环单核细胞来源的巨噬细胞（Ccr2+和Il1β+）和心脏驻留巨噬细胞（Lyve1+和Timd4+）。有趣的是，scRNA测序显示，一小部分循环单核细胞来源的巨噬细胞表达Acta2（SMA）和Tagln，这是典型的肌成纤维细胞标记物（图1D）。然后作者使用scVelo来可视化RNA速度，并推断出伪时轨迹表明循环单核细胞源性巨噬细胞与肌成纤维细胞之间可能存在联系（图1E，附图 1D ）。
为了确定参与心脏中MMT和病理性心脏纤维化调控的分子机制，作者重新分析了单细胞RNA测序数据。生物信息学分析显示，RNA N6-甲基腺苷去甲基酶ALKBH5在心脏的所有聚类中广泛表达，而在巨噬细胞聚类中变异性更大（附图 4A ）。作者接下来分析了巨噬细胞亚聚类中ALKBH5的表达情况，并通过点图（图2A）和热图（图2B）观察到与巨噬细胞群体相比，肌成纤维细胞中ALKBH5的表达更高。伪时分析进一步表明，ALKBH5的表达水平与Acta2的表达呈平行关系（图2C）。Vilon图像也显示了在MMT过程中ALKBH5表达的增加（图2D）。
特定删除Cx3cr1谱系中的ALKBH5改善Ang II或压力过载诱导的MMT和心脏纤维化作者接下来构建了Cx3cr1cre; Rosa26 Td ; ALKBH5 flox/flox (ALKBH5 macKO-Td , KO)小鼠，以研究巨噬细胞ALKBH5在MMT和病理性心脏纤维化中的作用。与对照小鼠（Cx3cr1cre; Rosa26 Td ; ALKBH5 wt/wt , WT）相比，ALKBH5 macKO-Td 小鼠腹腔巨噬细胞中ALKBH5的表达显著降低（附图 5A ，RIP测序数据集）。作者首先确定了ALKBH5缺失对体内和体外MMT的影响。ALKBH5缺失不会改变心脏中的Td+细胞在稳态或挑战后的数量（图2G）。高血压心脏中，ALKBH5 macKO-Td 小鼠显示出SMA+Td+细胞显著减少（图2G），并且在分选的Td+细胞中SMA和ECM基因胶原I和III的mRNA水平也减少（图2I）。与体内发现一致，作者发现Ang II增加了但ALKBH5基因敲除逆转了Ang II处理后培养的巨噬细胞中SMA+Td+肌成纤维细胞样细胞形成和SMA和ECM基因胶原I和III的表达（图2I, I,JJ）。
ALKBH5在循环单核细胞衍生的巨噬细胞中对高血压引起的心脏纤维化和功能障碍起作用为了确定ALKBH5对心脏驻留巨噬细胞的MMT和心脏纤维化的影响，作者生成了Cx3cr1Cre ERT2 ; Rosa26 Td ; ALKBH5 flox/flox 小鼠，以在心脏驻留巨噬细胞中删除ALKBH5（附图 7A ）。根据先前的研究 12 ，Td+主要标记心脏Lyve1+驻留巨噬细胞，并且ALKBH5的删除对稳定和高血压状态下的Td+细胞群集没有显著影响（附图 7B ）。与Cx3cr1Cre ERT2 ; Rosa26 Td ; ALKBH5 wt/wt （Cx3cr1Cre ERT2 ; Rosa26 Td ）小鼠相比，Cx3cr1Cre ERT2 ; Rosa26 Td ; ALKBH5 flox/flox 小鼠在心脏中通过FACS评估的高血压诱导的MMT方面没有显著变化（附图 7B ）。在稳定和高血压状态下，与Cx3cr1Cre; Rosa26 Td 小鼠相比，Cx3cr1Cre ERT2 ; Rosa26 Td ; ALKBH5 flox/flox 小鼠的心脏纤维化和舒张功能没有差异（附图 7C – E ）。
ALKBH5通过调节Cx3cr1衍生的巨噬细胞上IL-11 mRNA的m6A修饰，促进MMT和心脏纤维化为了研究ALKBH5在高血压下调节MMT和心脏纤维化的机制，作者在培养的巨噬细胞中进行了ALKBH5 RNA免疫沉淀测序（RIP-seq）实验，并发现几个基因是ALKBH5的直接靶标（图5A）。进行了通路富集分析，展示了ALKBH5对Ang II响应的通路。在富集的前10个通路中，作者观察到Tgf-beita信号通路与ALKBH5相关，进一步表明巨噬细胞ALKBH5参与了Ang II诱导的巨噬细胞-肌成纤维细胞转化过程（图5B）。此外，Ang II显著增加了ALKBH5在IL-11 mRNA上的富集，这是富集最丰富的靶向mRNA（图5A，补充数据）。因此，作者假设IL-11 mRNA可能是ALKBH5直接调控的m6A靶标。接下来，作者在ALKBH5敲除和对照巨噬细胞中进行了m6A RNA免疫沉淀测序实验，并发现GGAC基序在控制组和ALKBH5敲除组的m6A位点中富集程度较高（图5C）。m6A峰值特别丰富在起始和终止密码子附近（图5D）。m 6 A峰富集在IL-11 mRNA上（图5E），通过m6A RIP-qPCR使用在peak1和peak2区域的引物进行确认（图5F）。然后，作者评估了m6A调控的RNA降解，并发现在ALKBH5缺乏的巨噬细胞中，IL-11 mRNA降解速度更快（图5G）。这些数据表明，巨噬细胞中的ALKBH5缺乏增加了IL-11 mRNA上的m6A修饰，导致IL-11稳定性降低。
纳米颗粒单核细胞/巨噬细胞靶向输送ALKBH5或IL11RA1 siRNA减轻Ang II诱导的心脏纤维化和功能障碍脂质纳米粒子（LNP）-mRNA技术被广泛用于靶向免疫细胞，尤其是在各种动物模型中的单核细胞衍生巨噬细胞 22 。因此，作者生成了DiR修饰的LNPs C12-200 23,24 ，成功用于靶向循环单核细胞（图7A）。通过动态光散射和冷冻透射电子显微镜观察LNPs的尺寸分布和ζ电位（图7B-D）。然后，作者将封装在单核细胞/巨噬细胞靶向DiR修饰的LNPs C12-200中的ALKBH5或IL11RA1 siRNA输送到高血压应激下减轻心脏纤维化和功能障碍（图7E）。荧光成像结合微CT显示纳米颗粒成功分布在Ang II输注后的心脏中（图7F）。封装ALKBH5 siRNA的LNPs通过降低E/e'比值改善了Ang II诱导的心脏功能障碍（图7G, G,H）。Masson三色染色显示LNP介导的ALKBH5沉默显著改善了Ang II输注引起的心脏纤维化（图7I）。ALKBH5沉默减少了SMA阳性细胞（图 7J），并且在Ang II注入的心脏中表达了SMA和胶原蛋白I和III（图7K）。同样，IL11RA1 siRNA封装的LNPs治疗改善了心脏功能并减轻了心脏纤维化（附图 11A - D ）。这些结果表明，靶向巨噬细胞-ALKBH5-IL-11/IL11RA1通路可能为病理性心脏重塑提供一种新的治疗方法。总结 综上所述，作者发现ALKBH5-IL-11-IL11RA1通路激活介导的巨噬细胞向肌成纤维细胞的转化代表了一种对病理性心脏纤维化有贡献的新机制。尽管人类病理性心脏纤维化的复杂性比小鼠模型更高级，但作者的新发现表明，通过 LNP-siRNA 技术以靶向心脏巨噬细胞中的 ALKBH5-IL-11-IL11RA1 通路可能作为心脏疾病中心脏纤维化预防的潜在治疗工具。
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