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结果： 从TCGA数据库下载的546个HNSCC样本（44个正常样本和502个肿瘤样本）的数据进行了分析。根据546个HNSCC样本中的昼夜节律基因 15 的表达水平，通过正常样本和肿瘤样本之间的差异分析，共获得了268个与昼夜节律相关的基因（图1A）。火山图可视化了上调和下调的昼夜节律相关基因（图1B）。
根据这268个与昼夜节律相关的基因在HNSCC样本中的表达，利用NMF算法将HNSCC患者分为多个簇。根据NMF等级调查中的cophenetic、离散度、残差和轮廓系数以及热图（图1C、D）的结果，HNSCC队列被分为簇1和簇2。此外，Kaplan-Meier（K-M）总生存曲线显示，簇1患者的预后优于簇2患者（图1E）（P < 0.001），这表明两个簇是区分HNSCC患者预后的最佳分类方式。为了构建HNSCC患者的预后标志，作者随机将499名具有完整临床数据的患者按照7:3的比例分为训练组和测试组。训练组包括351名患者，测试组包括148名患者。在训练组中，通过单变量Cox回归分析获得了与预后相关的29个昼夜节律基因，并通过LASSO回归分析进一步筛选出了15个基因（ADA、ICOS、SEC61G、ALG3、CBX3、STC1、BASP1、CYP4X1、DCBLD1、DHCR7、EZH2、OLR1、PLEKHA6、PTPRN2和STARD4）（图2A、B）。最后，通过多变量Cox回归分析，使用9个昼夜节律基因（ADA、ICOS、ALG3、STC1、CYP4X1、EZH2、OLR1、PLEKHA6和STARD4）构建了CRRGPI。CRRGPI的计算公式如下：CRRGPI = ADA*0.274416 + ICOS*-0.408837 + ALG3*0.289390 + STC1*0.142689 + CYP4X1*-0.139852 + EZH2*-0.238670 + OLR1*0.151689 + PLEKHA6*0.296361 + STARD4*0.420515。根据使用50%作为分界值的样本的CRRGPI得分，将测试组和训练组的样本分为高CRRGPI组和低CRRGPI组。此外，作者使用训练队列的数据来评估CRRGPI在预测患者生存率方面的价值。如图2C所示，高CRRGPI组患者的总生存期较低CRRGPI组患者更差（P < 0.001），表明CRRGPI是一个不良预后因子。这一效果在测试队列（P < 0.005）和整个TCGA队列（P < 0.001）中得到了进一步验证（图2D、E）。根据CRRGPI，作者对GEO数据集的每个样本进行评分，然后分析患者的总生存期（图2F）。结果与TCGA队列一致，高CRRGPI组患者的总生存期较差（P = 0.026），进一步证实了作者开发的CRRGPI的稳定性。 
CRRGPI作为独立的HNSCC预后因素的评估
单变量Cox回归、多变量Cox回归和受试者工作特征（ROC）分析被用来确定CRRGPI是否具有HNSCC总生存的预后价值，独立于年龄、病理分期、性别、PDCD1、CD274和TMB等临床病理指标。CRRGPI在单变量Cox回归评估中的风险比（HR）和95%置信区间（CI）分别为1.566和1.394-1.759（P < 0.001），在多变量Cox回归评估中的风险比（HR）和95%置信区间（CI）分别为1.567和1.351-1.817（P < 0.001）（图3A-B）。CRRGPI在HNSCC无进展生存中也具有预后价值（附图1）。此外，作者构建了一个包括年龄、病理分期、性别、PDCD1、CD274、TMB和CRRGPI的预后预测诊断图（图3C）。预测曲线显示，一年、三年、五年和十年的生存概率的预测值与观察值具有高度一致性（图3D）。最后，进行ROC分析评估CRRGPI的预测能力。所有HNSCC患者的时间相关ROC曲线下面积（AUC）为0.659、0.693、0.668，以及一年、三年、五年和十年的OS分别为0.762（图3E）。训练队列（图3F）和测试队列（图3G）在1年、3年、5年和10年的AUC分别为0.660、0.686、0.695和0.822，以及0.671、0.722、0.654和0.656。CRRGPI在GEO数据集中也被证实具有良好的预测性能（附图2A）。此外，为了验证CRRGPI的优越预测能力，作者将其与两个常用的预测性生物标志物肿瘤免疫功能障碍和排斥（TIDE）分数和肿瘤炎症特征（TIS）进行了比较。ROC曲线结果显示，CRRGPI比文献中先前报道的两个基因集具有更好的预测能力（附图2B）。这些结果表明，CRRGPI在预测HNSCC患者的OS方面表现良好。
此外，根据患者的临床病理特征，进行了亚组生存分析。K-M生存曲线分析显示不同年龄、性别（P < 0.001）（附图3）和分期（P < 0.05）（图4A、B）的生存率存在显著差异。此外，根据患者先前的治疗史，将患者分为放射治疗、非放射治疗、分子靶向治疗和非分子靶向治疗亚组。在这四个亚组中，高CRRGPI组的患者比低CRRGPI组的患者有更差的总生存率（P < 0.05）（图4C-F）。这表明CRRGPI在这四个亚组中具有优秀的区分患者预后的能力。
为了探索不同CRRGPI组的分子特征，作者使用GSEA算法评估了这些组之间差异表达基因（DEGs）的富集情况。根据KEGG数据库，作者的结果显示高CRRGPI组富集的基因主要与基底细胞癌、细胞外基质（ECM）受体相互作用、黏多糖生物合成软骨硫酸盐以及癌症途径相关（图5A），而低CRRGPI组富集的基因主要涉及移植排斥、哮喘、自身免疫性甲状腺疾病、趋化因子信号通路以及原发性免疫缺陷（图5B）。GSEA数据的详细信息可在附表1中找到。此外，为了探索高CRRGPI组和低CRRGPI组之间的细胞功能差异，作者进行了KEGG和GO功能通路富集分析，以分析这两组之间的DEGs（图5C、D）。
此外，为了比较不同CRRGPI组之间的免疫特征，作者分析了不同CRRGPI组中的TMB。结果显示，两个CRRGPI组之间的TMB没有显著差异（94.47% vs. 91.89%，P = 0.088），但作者观察到在两个组中，具有最高突变频率的基因是TP53（图6A）。错义突变是最常见的类型，高CRRGPI组的TP53突变频率高于低CRRGPI组（80% vs. 59%）（图6A）。在头颈部鳞状细胞癌中，肿瘤抑制基因p53存在高频率的功能丧失突变，这导致更多新抗原的产生并激活抗肿瘤免疫反应，从而增加免疫细胞对肿瘤的浸润。这些抗肿瘤反应可以改善头颈部鳞状细胞癌患者的治疗效果。 
CRRGPI与抗肿瘤免疫的七个步骤之间的关系
抗癌免疫反应可以概念化为一系列事件，包括癌症抗原的释放（步骤1），癌症抗原呈递（步骤2），启动和激活（步骤3），免疫细胞运输到肿瘤（步骤4），免疫细胞浸润肿瘤（步骤5），T细胞识别癌细胞（步骤6）和杀死癌细胞（步骤7）。这些过程不仅反映了肿瘤识别和杀伤的过程，还影响了癌症免疫治疗的结果。为了探索CRRGPI评分对七个抗肿瘤反应步骤中的28种免疫细胞类型的影响，作者从TIP数据库下载了七个步骤的特征基因（附表2），并分析了每个过程的特点。随后，作者使用非参数检验比较了不同CRRGPI组患者的七个抗肿瘤步骤。如图7所示，释放和呈递肿瘤抗体的能力（步骤1和2）没有显著差异（图7A）。然而，与高CRRGPI组相比，低CRRGPI组的免疫细胞启动和激活能力显著提高（步骤3）（P < 0.001）（图7A），低CRRGPI组的总趋化能力明显优于高CRRGPI组（步骤4）（图7B）。具体而言，低CRRGPI组的CD4 T细胞、CD8 T细胞、Th1细胞、树突状细胞、Th22细胞、巨噬细胞、NK细胞、Th17细胞、B细胞、Th2细胞和Treg细胞的趋化能力均强于高CRRGPI组。接下来，在免疫细胞浸润肿瘤的能力方面（步骤5）（图7C），低CRRGPI组的患者明显更强（P < 0.001）。然而，在T细胞识别癌细胞的过程中，低CRRGPI患者的能力明显低于高CRRGPI患者（步骤6）（P < 0.05）（图7C），低CRRGPI患者在杀伤肿瘤细胞的能力方面优于高CRRGPI患者（步骤7）（P < 0.05）（图7C）。
为了比较不同CRRGPI分数患者的免疫特征，作者使用CIBERSORT算法全面比较了两个CRRGPI组中22种免疫浸润细胞的富集情况。如图所示，作者发现低CRRGPI组中的天然B细胞、浆细胞、CD8 T细胞、记忆激活CD4 T细胞、滤泡辅助T细胞、调节性T细胞、活化NK细胞、M1巨噬细胞、静止树突细胞和静止肥大细胞的富集水平较高，而高CRRGPI组中的记忆静止CD4 T细胞、静止NK细胞、M0巨噬细胞、M2巨噬细胞和活化树突细胞的富集水平较高（图8A）（P < 0.05）。此外，作者还使用ESTIMATE算法评估了不同组别的肿瘤微环境成分。最后，作者计算了每个患者样本的ESTIMATE评分、免疫评分和基质评分，以比较肿瘤微环境的组成特征。ESTIMATE评分是免疫评分和基质评分的总和，可以反映患者微环境中免疫细胞与基质细胞的比例，并预测肿瘤纯度。ESTIMATE得分越高，免疫得分与基质得分的比例也越高，这表明肿瘤细胞的比例较低。作者的研究结果显示，高CRRGPI的HNSCC患者的ESTIMATE得分和免疫得分均低于低CRRGPI的HNSCC患者（P < 0.001），而两组之间的基质得分没有显著差异（图8B），这与CIBERSORT算法的结果相似。
由于CRRGPI能够区分HNSCC患者的操作系统，并与多种抗肿瘤免疫反应过程相关，作者推测CRRGPI可能可用于预测哪些患者可以从ICIs中获益。首先，作者使用相关性分析评估了CRRGPI与一些免疫检查点相关基因（包括PDCD1（PD1）、CD274（PD-L1）和CTLA4）之间的相关性。结果显示，CRRGPI与常用的免疫检查点相关基因呈负相关（附图4），低CRRGPI组患者中PD1、PD-L1和CTLA4的表达水平高于高CRRGPI组。许多研究表明，免疫检查点蛋白（如PD1、PD-L1和CTLA4）的表达越高，对癌症患者的临床益处越大。总之，作者预测低CRRGPI组的患者更有可能从ICIs中获益。然后，作者使用TIDE算法进一步评估不同亚组中免疫检查点抑制剂（ICIs）的临床益处。作者发现，CRRGPI评分低的患者T细胞功能障碍评分较高，而CRRGPI评分高的患者T细胞排斥评分较高（图9A、B）（P < 0.001）。此外，IFNG和Merck18（图9C、D），可以反映释放IFN-γ的能力，显示CRRGPI评分低的患者能够释放更多的IFN-γ，这意味着更强的杀伤肿瘤能力（P < 0.001）。另外，促进肿瘤免疫逃逸的三种抑制细胞类型，M2-TAMs、CAFs和MDSCs的水平表明，在CRRGPI评分高的患者中更容易发生免疫逃逸（图9E-G）。最后，通过对以上结果进行综合评估得出TIDE评分。TIDE评分越高，逃避免疫监视的能力越强，这意味着这些患者可能无法从免疫疗法中获益。在作者的结果中，CRRGPI评分低的患者的TIDE评分明显高于高CRRGPI组（P < 0.001），这意味着CRRGPI得分低的患者不太可能从ICIs中获益（图9H）。由于TIDE得分预测的免疫疗法疗效与抗肿瘤步骤预测的疗效不一致，作者进一步使用临床队列评估CRRGPI在不同CRRGPI组中预测免疫疗法效果的能力。在膀胱癌的IMvigor210队列中，CRRGPI得分低的患者显示出更好的总体生存趋势（图9I）（P = 0.067）。根据之前的结果，作者预测低CRRGPI组的患者在接受ICIs治疗时可能会获得临床益处。
CRRGPI 与药物敏感性的相关性 IC50，即50%抑制浓度，表示药物在抑制肿瘤细胞方面所需的浓度，通常用作药物敏感性的衡量标准。也就是说，药物在肿瘤细胞中的IC50值越低，肿瘤细胞对该药物越敏感。为了根据IC50数据探索可能用于治疗HNSCC的潜在化疗药物，作者使用pRRophetic软件包分析了每个患者的CRRGPI与多种化疗药物的IC50值之间的相关性，并探索了高和低CRRGPI组患者的药物敏感性。作者观察到，在低CRRGPI组中，有28种药物的IC50值低于高CRRGPI组，这意味着CRRGPI评分低的患者对这些药物更敏感，其中包括5-氟尿嘧啶、ZSTK474、吡咯甲胺、鲁索利替尼、苯乙双胍和AS-605240（图10A-F）。5-氟尿嘧啶是一种可用于治疗HNSCC的化疗药物。ZSTK474和AS-605240都是PI3K抑制剂。Sho等人。报道称，PI3K抑制剂与免疫检查点阻断联合使用可以抑制Tregs并产生记忆CD8 + T细胞，从而产生持久的抗肿瘤免疫。Ruxolitinib是一种选择性抑制Janus激酶（JAK）1和2的药物，在骨髓纤维化患者中可以提供显著的临床益处并改善OS。Phenformin是二甲双胍的衍生物，具有更高的抗癌效力，剂量较低时可以通过激活AMPK信号通路和抑制EGFR信号来有效抑制膀胱癌生长。同时，作者发现高CRRGPI组对吡咯甲嗪更敏感。吡咯甲嗪是一类抗叶酸药物，可以阻断二氢叶酸还原酶。多项研究已报道吡咯甲嗪可以通过多种机制诱导抗肿瘤免疫效应，如诱导依赖于半胱氨酸蛋白酶B和依赖于半胱氨酸蛋白酶的凋亡途径以及抑制STAT3。
总结 总之，CRRGPI 可以全面评估 HNSCC 患者的预后和生物学特征，包括代谢、肿瘤干细胞性质和免疫微环境，并预测潜在的免疫治疗反应。此外，CRRGPI 可能是指导 HNSCC 个体化治疗方案的预后标志物。
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