【原】【LorMe周刊】共生菌助力病原菌“逃脱”宿主营养免疫

LorMe青年 2024-04-22 发布于江苏

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作者：苏熠，南京农业大学博士在读，主要研究铁载体介导的病原菌与根际微生物互作

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊介绍共生菌在沙门氏菌感染中影响宿主营养免疫的机制。原文于2023年10月发表在《Cell Host & Microbe》上。

导读

宿主能够利用微生物对铁和其他金属的依赖来调控微生物生长，这一过程称为营养免疫。病原体通过铁载体与宿主竞争铁从而缓解铁素缺乏的情况，而宿主则通过分泌lipocalin-2脂质运载蛋白螯合病原菌分泌的铁载体，阻止病原菌获得铁素。在此过程中，肠道菌群处于铁限制的状态来参与宿主和病原菌之间的铁营养竞争。作者先前工作表明，拟杆菌Bacteroides thetaiotaomicron（Bt）可以利用其他微生物（包括沙门氏菌、大肠杆菌）产生的铁载体来获取铁素营养，但其分子机制仍不清楚，而且肠道共生菌在致病菌与宿主营养免疫之间充当的角色尚未可知。在本文中，作者研究表明Bt将脂蛋白（XusB）分泌到细胞表面并进入细胞外环境以获得外源铁载体，该过程消除了宿主lipocalin-2介导的铁载体隔离，且导致肠道炎症的病原菌——沙门氏菌可以重新利用共生菌分泌的脂蛋白所结合的铁载体，从而逃脱宿主的营养免疫。

主要结果

1、Bacteroides thetaiotaomicron（Bt）通过其特有的机制来获取外源铁载体

在Bt中，外源铁载体利用系统编码三个基因（XusABC）（图1A），其中XusA有助于Bt在动物结肠炎模型中的定殖，XusB的具体作用未知。作者通过序列分析预测XusB是位于细胞表面的脂蛋白（图1B），通过蛋白酶K处理验证该猜测（图1C），并利用细胞分级实验证实其存在于外膜囊泡（OMV）中（图1D）。

图1：脂蛋白XusB在外膜囊泡（OMV）中富集

作者之前的研究发现儿茶酚型铁载体、肠杆菌素和沙门氏菌素等外源铁载体是Xus系统的配体，维持着Bt的生长。XusB与肠杆菌素具有高亲和力，与入侵的病原体竞争铁营养（图2）。

图2：XusB与肠杆菌素结合具有很高的亲和力

2、XusB参与外源铁载体的获取

由于XusB与肠杆菌素有很强的亲和力，在外源铁载体利用中发挥着重要的作用，并且XusB能够被分泌到细胞外，因此作者接下来想要探究XusB是否在胞外发挥获取铁载体的功能。他们首先分离了OMV及上清液，将其与肠杆菌素共孵育，随后去除未结合的肠杆菌素，将不同组分加入受体细胞培养基中作为唯一铁源（图3A）。在铁限制条件下，来自Bt野生型菌株的载有肠杆菌素的OMV可以支持野生型受体细胞的生长，但不支持BtΔxusA（缺乏xusA的突变体）和BtΔxusB（缺乏xusB的突变体）生长（图3B）。相比之下，去除OMV后剩余的上清液、BtΔxusB及BtΔxusB xusB_C23A（肠杆菌素结合缺陷突变株）提供的OMV不能促进任何受体细胞的生长（图3B、C），补充载有肠杆菌素的OMV能够显著增加野生型菌株胞内的铁含量（图3D）。这表明OMV相关的XusB可以在细胞外环境中捕获肠杆菌素从而促进Bt生长。

图3：XusB参与外源铁载体的获取

3、XusB有助于Bt在沙门氏菌Salmonella Typhimurium（S.Tm）感染期间恢复生长

鉴于外源铁载体利用对于炎症肠道中共生菌的恢复至关重要，作者假设XusB在肠道炎症期间有助于对Bt的恢复。为了验证这一假设，作者给被抗生素清除了肠道菌群的无菌小鼠分别接种BtWT和BtΔxusB、Bt WT和ΔxusB xusB_C23A，两天后灌胃沙门氏菌野生型和不能产生铁载体的S.TmΔentB（图4A），四天后测定肠道的Bt和S. Tm的丰度，发现沙门氏菌感染期间肠道内铁含量降低（图4B），且在野生型沙门氏菌感染条件下，BtWT比BtΔxusB或BtΔxusB xusB_C23A更具竞争优势，但在S.TmΔentB感染条件下，BtWT不具生存优势（图4C）。

之后作者为了更直接地证明XusB有助于Bt在S.Tm感染期间的恢复，将BtWT和BtΔxusB定殖于被抗生素清除了肠道菌群的无菌小鼠肠道两天后，用沙门氏菌（S.Tm WT和S.TmΔentB）感染四天（图4D），Bt和S. Tm的丰度结果表明，在S. Tm WT感染下，BtΔxusB定殖能力下降，在S. TmΔentB感染的小鼠中，Bt各菌株之间无明显差异（图4E、F）。综合这些数据表明，XusB参与外源铁载体获取并有助于Bt在沙门氏菌感染期间的恢复。

图4：XusB有助于Bt在沙门氏菌感染期间的恢复

4、XusB在体外调节种间铁载体的竞争

由于含有XusB的OMV能够捕获外源铁载体，并且XusB结合的肠杆菌素的传递需要菌株受体细胞产生XusB，于是作者猜测XusB可以从其他竞争物种中螯合肠杆菌素。于是在表达XusB同源物的拟杆菌B. vulgatus中分别添加了游离的肠杆菌素和XusB结合的肠杆菌素。结果表明，游离的肠杆菌素可以被B. vulgatus利用，而XusB结合的肠杆菌素无法被利用（图5A、B）。说明XusB及其同源物可能介导了细菌之间的铁载体竞争。

为进一步探索XusB在拟杆菌门之外的物种间相互作用中的影响，作者将XusB结合的Fe-Ent（肠杆菌素）提供给S.TmΔentB作为唯一铁源，在XusB+Fe-Ent的OMVs处理下S.TmΔentB生长迅速，而BtΔxusB或BtΔxusB xusB_entMT +Fe-Ent（接触到肠杆菌素的六个XusB残基突变为丙氨酸，不能利用肠杆菌素作为唯一的铁源）的OMV不支持S.TmΔentB菌株的生长（图5C、D）。大肠杆菌BW25113ΔentB也得到了和S.TmΔentB相同的结果（图5E、F）。

另外，添加蛋白酶抑制剂后沙门氏菌和大肠杆菌仍然可以利用XusB结合的Fe-Ent，（图5E、F），这说明拟杆菌XusB结合的Fe-Ent并不是被蛋白酶水解后释放到环境中的。作者进一步使用Keio小规模筛选发现，对于沙门氏菌和大肠杆菌来说，外膜嵌入的TonB依赖性肠杆菌素转运蛋白FepA（TonB-dependent enterobactin transporter FepA）对利用XusB结合的Fe-Ent是必要的（图5D、F）。这些结果表明，Bt通过特殊机制来捕获铁载体。该机制介导了拟杆菌之间的铁载体竞争，但也可能被变形菌门（如S. Tm和大肠杆菌）利用。

图5：XusB在物种间铁载体竞争中的作用

5、共生菌外源铁载体的获取改变体外营养免疫

之后为了研究外源铁载体结合蛋白XusB等是否可以帮助病原菌在感染期间抵抗宿主的营养免疫。作者在加入了铁螯合剂BPS和lipocalin-2（宿主铁载体隔离蛋白）的半限定培养基中共培养S.TmWT和S.TmΔfepA iroN（无法利用铁载体）（图5A）。结果表明，S.Tm WT与突变株相比具有生长优势，并且在添加XusB后，野生型菌株的优势更加明显（图6B）。且添加含有XusB-Fe-Ent的OMV处理的结果也与上述结果表型一致（图6C）。

这些结果共表明，拟杆菌分泌的外源铁载体结合蛋白可以在病原体入侵期间帮助病原菌抵抗宿主营养免疫。

图6：XusB在体外调节沙门氏菌和lipocalin-2之间的相互作用

6、共生菌外源铁载体的获取改变体内营养免疫

作者首先使用无菌动物模型探索了XusB与OMVs的关联，将Bt WT和BtΔxusB定殖于无菌小鼠，七天后收集肠内容物的OMVs进行蛋白质组分析（图7A），发现只有Bt WT处理的小鼠OMVs中存在XusB（图7B）。

接下来，作者将Bt WT和BtΔxusB在常规小鼠中定殖，并在两天后接种等量的S.Tm WT和S.TmΔfepA iroN。四天后收集肠内容物比较两种沙门氏菌的定殖差异，发现，在Bt WT处理的小鼠中，S.Tm WT相较于S.TmΔfepA iroN在竞争中表现出更大的生存优势（图7C、D）。为了进一步证实该结论，作者预定殖BtΔxusB，接种等量S.Tm WT及BtΔfepA iroN后，灌胃等量的BtWT-OMV及BtΔxusB -OMV，结果与先前一致（图7E、F）。

为了进一步排除肠道中其他微生物的影响，作者使用无菌小鼠重复以上处理。发现与常规小鼠相比，Bt WT与BtΔxusB数量无明显差异（图7H），这可能是由于它们与其他肠道微生物的竞争较少，而S.Tm WT和S.TmΔfepA iroN相比，S.TmΔfepA iroN的生存优势更大（图7I）。综上所述，在沙门氏菌感染期间，共生菌分泌的铁载体结合蛋白XusB可以帮助病原菌沙门氏菌抵抗宿主营养免疫。