【原】图解原代细胞 | 第5期. 一文搞定肺组织原代成纤维细胞

在前面的推送中，我们一起学习了脾脏T细胞、肺动脉平滑肌细胞、骨髓BMDM（详见基础科研系列合集）提取方法和特性，还提及原代细胞提取的共性要点，今天我们将进一步学习肺组织中另一类重要的细胞——成纤维细胞，利用原代细胞常用的提取方法：酶解法和组织贴壁法实现肺原代成纤维细胞的成功提取与培养。

准备工作

试剂和器械

高糖 DMEM培养基( Gibco) ，胎牛血清( FBS，Gibco) ，磷酸缓冲盐溶液( PBS，Gibco) ，Hank’s 平衡盐溶液(HBSS，Gibco)，0.25%胰蛋白酶( Gibco, 25200-056)，胶原酶/分离酶 (Roche, 10269638001)，DMSO( Sigma) ，75%酒精，T25培养瓶，10cm培养皿，移液器，枪头，灭菌的取材器械

操作流程

取材、分离培养、传代、鉴定

1.

小鼠肺组织的取材

（所有步骤均应在无菌条件下进行）

（1）脱椎处死小鼠，用75%酒精浸泡喷洒小鼠体表，从颈部打开胸腔（避免与腹腔相通，减少污染风险），暴露肺组织。

（2）快速取出肺组织，放入装有2ml HBSS 的10 cm 培养皿中，去除周围结缔组织，加入适量 HBSS冲洗 2-3 遍，至肺组织微微发白以减少肺组织中的红细胞。

2.

原代成纤维细胞的分离培养

（酶解法和组织贴壁法）

2.1

酶解法：培养周期短，操作步骤简单

（1）将肺组织置于新的培养皿中，用眼科剪将肺组织充分剪碎至呈糊状（如图1）。

图1 组织剪碎成糊状^[1]

（2）将剪碎的组织转移至1.5ml ep管，每50mg肺组织加入0.5ml 浓度为1mg/ml胶原酶/分离酶(Roche, 10269638001)，确保组织充分解离;

（3）在37℃、 CO2培养箱中，解离30 分钟。

（4）室温下1000 x g 离心5分钟，去上清。

（5）加入1ml HBSS 洗涤细胞，室温下1000 x g 离心5分钟，去上清。

（6）每50mg肺组织加入0.5ml 0.25%胰蛋白酶再次酶解细胞，37℃培养箱孵育30分钟。

（7）室温下1000 x g 离心5分钟，去上清。

（8）用DMEM培养基重悬细胞，6孔板铺板，置于 5% CO2 、37 ℃的培养箱中培养。

图2 显微镜下观测到6孔板中的成纤维细胞^[1]

2.2

组织贴壁法：培养周期长，但获得的原代细胞相对更纯

（1）将肺组织转移至10cm 培养皿中剪碎至糊状，加入 200μL胎牛血清，混匀。

（2）用 1 mL 一次性无菌吸管吸取肺组织均匀铺于 T25培养瓶中，此过程应将肺组织碎块充分分离铺匀，每个组织块之间间隔约1 mm（每只小鼠肺组织可接种 2-3个 T25培养瓶）。

图3 肺组织块均匀铺于 T25 培养瓶示意图^[2]

（3）（关键步骤：组织贴片牢固贴壁）

将培养瓶缓慢翻转倒置（组织贴壁面朝上），向培养瓶中加入 2 mL含 12%-15%的 FBS的 DMEM培养基，置于培养箱中干贴壁 2 h（此步骤防止组织片缺水干燥）。

（4）干贴壁2 h后，缓慢翻转正置培养瓶，此时培养基与组织块浅浅接触。

（5）置于 5% CO2 、37 ℃的培养箱中培养，每 2 天更换培养基，操作应缓慢，避免组织块漂浮，连续培养7-9天（部分肺组织细胞生长缓慢，可适当延长培养时间）。

（6）7-9 天后，可观察到组织块周围有大量成纤维细胞爬出。

图4 大量原代成纤维细胞从组织团块中爬出[3]

4.

原代成纤维的传代

（1）第一次传代时间：酶解法获得的成纤维细胞培养到70-90%密度；组织贴壁法孵育7-9天后的细胞进行第一次传代。

（2）传代方法：弃去培养瓶中的旧培养基，PBS洗1-2次，胰蛋白酶消化40-60秒，1:2传代。置于5% CO2 、37 ℃的培养箱继续培养。

（3）传代次数：第一次传代后，每2-4天根据细胞密度换液或1:2传代 ，建议选取2-10代的原代细胞用于后续实验或冻存。

5.

原代成纤维的鉴定

（1）细胞形态：镜下观察成纤维细胞成长索形、条索状。

（2）免疫荧光：

图5 鬼笔环肽（Phalloidin )或α-平滑肌肌动蛋白（(alpha-SMA)免疫荧光染色为阳性[3]

（3）qPCR鉴定:

图6 qPCR 检测肺成纤维细胞相关基因的表达[3]

以上就是今天的分享内容啦，大家可以根据实验需求选取耗时更短的酶解法或纯度更高的贴壁法，按照上述步骤操作就能获得理想的原代成纤维细胞！

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参考文献：

[1] EDELMAN B L, REDENTE E F. Isolation and Characterization of Mouse Fibroblasts[M/OL]//ALPER S, JANSSEN W J. Lung Innate Immunity and Inflammation: Methods and Protocols. New York, NY: Springer, 2018: 59-67[2024-04-24]. 

[2] 改良组织法高效分离纯化成年小鼠肺成纤维细胞--《中华中医药学刊》2018年12期[EB/OL]. [2024-04-24].

[3] FUENTES-MATEOS R, SANTOS E, FERNÁNDEZ-MEDARDE A. Optimized Protocol for Isolation and Culture of Murine Neonatal Primary Lung Fibroblasts[J/OL]. Methods and Protocols, 2023, 6(1): 14[2024-04-24]. 

[4] 王嘉陵邓佳慧 肖军花. 成年小鼠肺成纤维细胞的分离纯化及原代培养[J/OL]. 基础医学与临床, 2012, 32(6): 713[2024-04-24]. 

[5] Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents[EB/OL]. [2024-04-24]. 

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