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视网膜是身体的视觉器官，能够将光信号转换为电信号，并通过视神经将信号传递给脑中枢形成视觉感知。视网膜的患病率随着年龄增长逐年提升，改善与年龄有关的视网膜损伤，治疗与年龄有关的视网膜疾病，是衰老研究中的重要一项。（图1）  2024年4月24日，中山大学中山眼科中心卓业鸿以及苏文如教授团队在美国国家科学院院刊《PNAS》上发表了一篇研究论文，名为《Senolytic and senomorphic agent procyanidin C1 alleviates structural and functional decline in the aged retina》。这项研究使用自然衰老的小鼠模型，观察衰老视网膜的变化，验证了葡萄籽提取物原花青素 C1 （PCC1） 在体外和体内的清除衰老细胞（senolytic）和恢复细胞活力（senomorphic）的特性，长期治疗可改善与年龄相关的视网膜损伤。通过高通量单细胞RNA测序（scRNA-seq），全面表征了PCC1给药后的视网膜景观，并破译了衰老的负荷增加和消除的分子基础。（图2）  早期衰老细胞(SnC)表现出氧化代谢增加、染色质重塑和对凋亡的抵抗，最终可能导致衰老晚期的慢性炎症。SnC分泌生物活性趋化因子、细胞因子、蛋白酶和生长因子，统称为衰老相关分泌表型(SASP)。SASP因子具有吸引先天免疫细胞、促进慢性炎症、诱导分泌旁细胞衰老、重塑组织微环境等多种作用。这些过程可能对SnC本身和邻近结构产生不利影响。当超过SnC积累的阈值时，最终会导致组织破坏和与年龄相关的病理特征。目前抗衰的两种主要策略:使用senolytics选择性消除SnC和使用senomorphics抑制SASP。在抗衰老药物治疗老年性视网膜疾病的研究方面虽有进展，但大多数药物只涉及一个单一的靶点，这削弱了它们的治疗效果。 原花青素C1 (PCC1)有望改善这一限制，它是一种神经保护剂和抗增殖剂，已被证实具有senomorphic和senolytic作用，表明其有逆转视网膜衰老和进一步减轻年龄相关疾病的潜力。然而，系统给药PCC1是否对老化视网膜有很好的治疗效果尚不清楚。此外，选择性消除与年龄相关的视网膜疾病的细胞衰老负担的治疗潜力仍有待探索。（图3）  首先，为了探讨衰老对视网膜功能的影响，研究人员记录了幼年和老年小鼠的视网膜电图(ERG)。发现正常的ERG反应随着年龄的增长而下降，即衰老视网膜的视觉感知下降。（图4）  而视网膜结构方面，年轻的视网膜杆状双极细胞(红细胞)和水平细胞(hc)与外丛状层(OPL)内的光感受器形成突触。在老年小鼠中，红细胞和hc的树突从OPL延伸到外核层(ONL)。另外，还发现衰老诱导星形胶质细胞和突触神经胶质活化、小胶质细胞数量增加。SnC及其分泌组SASP的检测方面，在老化的视网膜切片上可以识别出p16+ SnC。mRNA表达结果显示，Cdkn2a(编码p16)和Cdkn1a(编码p21)在衰老视网膜中增加，并伴有几种SASP因子的上调。（图5）  进一步量化视网膜的细胞衰老，研究人员使用流式细胞术(FC)进行了衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-GAL)染色。观察结果表明，视网膜自然老化伴随着SnC和SASP因子的积累，可能导致视网膜的形态改变和功能损伤。（图6）  研究人员接下来的目的，是探索SnC的消耗是否可以减轻细胞衰老带来的有害性改变。在体外，研究人员使用多种视网膜细胞系，包括661 W、BV2和ARPE-19，测试了PCC1的功效，结果显示PCC1显著降低了所有细胞系的细胞衰老。（图7）  在证实了PCC1在体外的衰老治疗作用后，研究人员开始研究体内减轻衰老负担的潜力。研究人员在标准饮食中混合或不混合PCC1，对14至16个月大的小鼠进行了4个月的治疗。超高效液相色谱(UPLC)验证PCC1确实进入了视网膜薄壁。随后的FC结果显示，与对照组相比，PCC1在整个视网膜细胞群中部分消除了表达SA-β-GAL、p16和p21的细胞，表明体内视网膜SnC的消耗。此外，PCC1还降低了SASP细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。 随后对减少细胞衰老是否可以转化为与年龄相关的视网膜功能障碍的恢复方面进行评估。通过对衰老和PCC1处理的视网膜进行了ERG和IF染色，ERG记录显示暗位a波、b波和光位b波的振幅增加，表明PCC1治疗后视力受损恢复。此外，在视网膜突触和神经胶质活化方面，PCC1治疗改善了老年小鼠红细胞和红细胞异常伸长的过程，还降低了老年小鼠大胶质细胞的GFAP免疫反应性和小胶质细胞的数量。总之，通过减轻衰老负担，PCC1治疗可以逆转衰老视网膜中与年龄相关的退行性结构重塑和功能损伤。（图8）  为了阐明PCC1的分子动力学，研究人员对幼龄(6- 8周龄)、老年(18- 20周龄)和经PCC1处理的老年小鼠的视网膜细胞进行了scRNA-seq分析。根据标记基因确定了11个主要细胞系。对比老年小鼠、年轻小鼠以及PCC1处理的老年小鼠之间的差异表达基因。结果表明PCC1治疗逆转了衰老诱导的视网膜功能障碍。值得注意的是，PCC1还通过增加NADH再生来增强线粒体功能。此外，PCC1治疗可减轻视网膜神经元中的神经细胞死亡、氧化应激和炎性MAPK信号。 利用CellChat，分析不同细胞类型之间复杂的通信网络。调节经典兴奋性突触可塑性的CADM信号在神经元和胶质细胞衰老过程中的显示减少，经PCC1处理后则可以保持相对不变。另外，NT信号的发现进一步支持了PCC1的神经保护作用，突出了其抗炎和组织再生特性。 小胶质细胞是视网膜炎症反应和病理疾病的关键介质。单细胞数据显示，与年轻组相比，老年组的小胶质细胞比例更高，PCC1治疗逆转了这一点。此外，PCC1治疗后小胶质细胞相关病理特征的下调表明其有可能缓解小胶质细胞年龄相关的神经退行性转录组。研究结果证明，PCC1逆转了与年龄相关的基因失调，并对视网膜中的各种细胞类型均具有显著的保护作用。（图9）  研究人员通过运用SenMayo基因集分析单细胞数据，研究者成功鉴定出一群衰老细胞，发现视网膜色素上皮细胞和小胶质细胞可能是衰老细胞在视网膜中的主要来源。进一步的比较分析揭示了PCC1在清除衰老细胞方面的作用机制：通过上调凋亡相关通路来发挥其清除衰老细胞的作用，同时，其抑制SASP的效果与抑制NF-κB和p38MAPK信号通路密切相关。通过TUNEL染色、流式细胞术和CCK-8实验，这些发现得到了进一步的证实。（图10）  研究团队还分析了两个公开的疾病数据集——新生血管性AMD (nAMD)患者脉络膜和RPE组织以及实验性糖尿病视网膜病（DR）小鼠模型视网膜组织的scRNA-seq数据集，探究细胞衰老是否与年龄相关的视网膜疾病有关。利用同上文的单细胞分析方法，一系列的分析揭示了衰老细胞在这些疾病发生和发展过程中的潜在作用。 为了进一步验证PCC1通过senolysis对DR的治疗作用，研究人员将人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)暴露于高浓度葡萄糖中，建立体外DR模型。FC分析显示，DR模型中细胞衰老增加，PCC1处理后细胞衰老减少。此外，PCC1显著降低促炎分子IL-6和VEGF-A的分泌，表明其能够减轻葡萄糖诱导的HRMEC的促炎和促血管生成特性。总的来说，SnC促进了视网膜相关疾病的病理反应，而PCC1在减缓这些疾病的进展方面显示出很大的希望。（图11）  综上，这项研究首次证实了PCC1对衰老视网膜的恢复作用。通过对SnC的选择性消除和SASP的抑制，PCC1逆转了老化视网膜的结构和功能损伤。这些发现表明了PCC1对老年视网膜的治疗作用及其在治疗与年龄相关的视网膜疾病方面的潜在用途。深入了解了植物化学化合物在视网膜疾病中的作用，也为该领域未来的临床研究开拓了道路。 https:///10.1073/pnas.2311028121 |
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