|
2024年4月26日
理化研究所
生产天然化合物微生物潜能的开发-在新弹性蛋白衍生物上发现强抗菌活性-
理化学研究所(理研)环境资源科学研究中心天然产物生物合成研究单元的高桥俊二组长、伊斯兰阿卜杜·阿卜杜·哈基姆胺基础科学特别研究员等联合研究小组用放线菌[1]Streptomyces sp. RK18-A0406分离到一种具有较强抗菌活性的新型弹性蛋白[2]衍生物。此次，联合研究小组通过使此前未被分析的SARP家族转录调控因子[3](Syo_1.56 )在Streptomyces sp. RK18-A0406中高表达，来诱导次生代谢物的生产，并研究已知的 另外，弹性蛋白的绝对立体构型[4]决定为6S。 此外，Syo_1.56还表明，它不会特异性地激活邻近生物合成基因簇( BGC ) [5]的表达，而是诱导两个不同位置的BGC的表达。 对获得的天然化合物的生物活性进行了评价，所有弹性蛋白对野生型金黄色葡萄球菌均有较强的抗菌活性，一些弹性蛋白衍生物具有抗疟疾活性和金属-β-内酰胺酶( MBL ) [6]抑制活性。
根据本研究成果，通过人为诱导转录调控因子的表达，激活放线菌中休眠的BGC，有望开发出新的抗菌化合物。
本研究刊登在科学杂志《Journal of Natural Products》在线版( 4月23日)上。 新型弹性蛋白衍生物的结构及生物活性 背景 放线菌生产具有多种结构和活性的次生代谢产物。 近年来，通过大规模的微生物基因组序列的解读和生物信息学分析，发现了很多BGC。 但是，在实验室培养条件下几乎所有的基因都是休眠的，不能充分发挥放线菌所具有的新型天然产物的生产能力。 休眠BGC的活化是获取具有独特化学结构、生物活性、作用机制的新型次生代谢产物的有前景的方法。 本研究着眼于尚未解析的SARP家族转录调控因子，研究了激活基因表达诱导新型天然化合物的生产。 研究方法和成果 使用SARP家族转录控制因子Fur22注)的氨基酸序列信息，从联合研究小组拥有的放线菌基因组序列数据库中探索了类似的序列。 结果在Streptomyces sp. RK18-A0406的基因组序列中，在未知的ⅱ型聚酮合酶[7]基因簇附近发现了功能不明的转录调控因子( Syo_1.56 )。 然后，我们用含有抗潮霉素基因的嵌入式载体(搬运工)向表达启动子下游克隆了syo_1.56基因。 将上述载体导入放线菌Streptomyces sp. RK18-A0406，用超高效液相色谱-质谱联用仪( UHPLC-MS ) [8]对所获得的转化株的培养提取液进行分析时，确认了在野生株的培养物中未检测到的多个代谢物的峰(图1 )。通过吸收光谱、高分辨率质谱和核磁共振( NMR )分析，预计生产的次生代谢产物的峰为已知的反霉素和新型弹性蛋白衍生物。 实际上，经过对转化株的大量培养纯化，成功地分离和确定了12种弹性蛋白衍生物( 10种为新化合物) (图1 )。 另外，syo_1.56基因位于ⅱ型聚缩酮合酶基因簇附近，但出乎意料，在转化株的培养液中未能检测到候选的次生代谢产物。 激活反霉素和弹性蛋白生物合成相关的两个BGC，提示Syo_1.56具有多方面调控因子的性质，而不是目前已知的通路特异性调控因子。
图1 Streptomyces sp. RK18-A0406代谢产物分析 培养菌体5天后，提取代谢产物，进行UHPLC-MS分析。 转录控制因子的导入株强烈诱导了在野生株中未检测到的反霉素(红峰)及弹性蛋白(蓝峰)类的生产。 根据分子量( MW )，分离的弹性蛋白衍生物分为弹性蛋白A(MW392 )、弹性蛋白B(MW406 )、弹性蛋白C(MW420 )和弹性蛋白( MW<392 )。 弹性蛋白的绝对立体配置决定为6S。 被分离出的弹性蛋白全部对野生型金黄色葡萄球菌显示出很强的抗菌活性，IC50值( 50%抑制浓度) [9]在0.5~2.6μg/mL的范围。 另外，调查了对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( MRSA ) [10]株的抗菌活性，甲状腺原氨酸显示出7.5~30μg/mL范围的最小发育阻止浓度( MIC )值。 发现弹性蛋白衍生物对MRSA的活性与分子量相关，弹性蛋白c最强，MIC值在2.5~6.0μg/mL的范围。 部分弹性蛋白衍生物对疟原虫( Plasmodium falciparum 3D7株)表现出中度至强烈的抗疟活性( IC50值为0.1~9.4µg/mL )。 对人细胞株( HeLa及HL-60 )没有明显的细胞毒性，这表明有可能作为抗疟药物开发。 在试管内( in vitro )研究了已知引起抗生素抗性的金属-β-内酰胺酶( MBL )的活性抑制效果。 有趣的是，与正对照卡托普利IC50值69微莫勒( μM，m (莫勒)为摩尔/升，1μM为百万分之一莫勒)相比，弹性蛋白A1、弹性蛋白BBB 原弹性蛋白不显示MBL抑制活性，提示与C6结合的酰基链对MBL抑制很重要。 注) Panthee S .，et al.furaquinocins I and j:novel polyketide isoprenoid hybrid compounds from Streptomyces reveromyceticus sn-593 .。 今后的期待 与放线菌中统一调控BGC的途径特异性转录调控因子不同，Syo_1.56激活了基因组上两个完全不同位置的BGC。 放线菌中这种途径非特异性转录调控因子的例子很少，通过有效利用这种转录调控因子，有望唤醒休眠BGC，获得结构多样、生物活性独特的新型天然化合物。 另外，弹性蛋白衍生物对野生株及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的结构活性相关、抗疟疾活性、MBL的活性抑制效果的研究，有望与未来的制药开发联系起来。 本研究成果为联合国制定的17个“可持续发展目标( SDGs ) [11]”中的“3 .为所有人提供健康和福利”做出了贡献。补充说明 1 .放线菌 是广泛存在于土壤中等自然界的真正细菌，生产结构复杂的次生代谢产物。 人类一直从它们之中利用医药、农药、动物药等具有生理活性的物质。 现在作为医药探索源也受到重视。 2 .弹性蛋白 1978年被大村智博士( 2015年诺贝尔生理学或医学奖获得者)分离出具有人粒细胞弹性蛋白酶抑制活性的聚缩酮化合物。 3.SARP家族转录调控因子 属于SARP家族的转录调控因子。 主要存在于Streptomyces属放线菌的次生代谢生物合成基因簇内，被称为途径特异性转录调控因子。 在调控与各种次生代谢物生产相关的生物合成基因簇中起重要作用，包括抗菌剂、抗真菌剂和抗肿瘤剂。 SARP是Streptomyces antibiotic regulatory protein的缩写。 4 .绝对立体配置 化合物的立体结构。 化合物的立体异构体即使原子数和种类相同，但在其空间构型不同的情况下不能重叠。 这种空间配置称为绝对配置，可以标记为r和s、e和z等进行分类。 化合物的绝对立体构型不同时，生理活性可能不同，因此其阐明很重要。 5 .生物合成基因簇( BGC ) 放线菌和丝状真菌等微生物次生代谢产物的生物合成中，所有相关基因都靠近基因组存在，形成簇。 转录调控因子等共同调控这些基因，高效产生次生代谢产物。 许多基因簇休眠，期待有效利用。 6 .金属-β-内酰胺酶( MBL ) 一种催化包括碳青霉烯在内的大范围β-内酰胺类抗生素水解的酶。 活性中心含有锌。 阻断MBL是恢复抗生素效果的方法之一。 7 .聚酮合酶 主要见于细菌、菌类、植物中，是生物合成聚缩酮( polyketide )化合物的酶。 存在ⅰ、ⅱ、ⅲ型3种。 聚酮化合物的一部分实际上被用作抗生素、抗癌剂、免疫抑制剂等医药品。 8 .超高效液相色谱质谱仪( UHPLC-MS ) 在大幅提高高效液相色谱( HPLC )的分离能力、速度、灵敏度的分析装置即UHPLC单元上，组合了质谱分析装置( MS )。 在UHPLC单元中可以根据化学特性的不同，在MS单元中可以根据质量的不同分离化合物。 因此，可以从复杂的混合物中快速解析目标化合物。 UHPLC-MS是ultra-high performance liquid chromatograph y-mass spectrometry的缩写。 9.IC50值( 50%抑制浓度) 50%阻碍细菌和细胞等生长的药物浓度。 该值越小表示具有越强的效果。 10 .耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( MRSA ) 对抗生素甲氧西林获得抗药性的金黄色葡萄球菌。 对抗生素产生抗药性，感染症治疗困难，因此在医疗现场成为问题。 MRSA是methicillin-resistant staphylococcus aureus的缩写。 11 .可持续发展目标( SDGs ) 成员国在2015年9月联合国峰会上一致通过的《可持续发展2030议程》所载2016-2030年15年实现的国际目标。 由实现可持续世界的17个终点、169个目标构成，不仅是发展中国家，发达国家自身也在努力实现通用(普遍)，日本也在积极地努力(从外务省主页进行了一部分变更后转载)。 SDGs是辅助开发工具的缩写。 联合研究组 理化研究所环境资源科学研究中心 天然产物生物合成研究单元 组合队长高桥俊二 基础科学特别研究员伊斯兰阿黛尔·阿卜杜勒·哈基姆胺( Islam Adel Abdelhakim Amin ) 特别研究员(研究当时)鬼头奈央子( kitonaoko ) 植物免疫研究组 集团总监白须贤 研究员增田幸子 技术人员ⅱ柴田亚里沙 分子结构分析单元 组合队长越野广雪 专职研究员村中厚哉 化合物资源开发研究单元 组合队长田裕之 高级研究员二村友史 北里大学大村智纪念研究所 教授浅见行弘 (理研环境资源科学研究中心天然产物生物合成研究单元客座研究员) 教授花木秀明 国立传染病研究所质量保证管理部 主任研究员石川淳 研究支援 本研究涉及日本学术振兴会( JSPS )科学研究费资助事业基础研究( a )“以天然化合物的多样性扩张为目标的生物合成分子基础的阐明(研究代表者:高桥俊二)”，该学术变革领域研究( a )“利用AI的未知的次生代谢生物合成酶的功能阐明和分子间相互作用的精密分析(研究代表者:高桥俊二) 抗菌活性及金属-β-内酰胺酶活性试验的一部分，在日本医疗研究开发机构( AMED )创药等生命科学研究支援基础事业创药等尖端技术支援基础平台( BINDS )的“大村天然化合物文库的扩充和以创药研究网络为基础的领先创造( JP22ama121035 )”的支持下进行。 原论文信息 Islam A. Abdelhakim、Yushi Futamura、Yukihiro Asami、Hideaki Hanaki、Naoko Kito、Sachiko Masuda、Arisa Shibata、Atsuya Muranaka Ken Shirasu、Hiroyuki Osada、Jun Ishikawa、and Shunji Takahashi、 " expression of syo _ 1.56 sarp regulator unveils potent elas nin derivatives with antibacterial activity "，Journal of Natural Products，" 主讲人 理化研究所 环境资源科学研究中心天然产物生物合成研究单元 组合队长高桥俊二 基础科学特别研究员伊斯兰阿黛尔·阿卜杜勒·哈基姆胺( Islam Adel Abdelhakim Amin ) 伊斯兰胺基础科学特别研究员高桥俊二单元领队合影
|
|
|
哈基姆胺(左)、高桥俊二(右)
