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众所周知，多细胞生物体内精确地基因表达网络调控，通过精确控制细胞命运协调组织器官的发育成熟。近年来，随着在动物或人类样本中使用单细胞转录组进行发育过程中密集采样时间点的高时间分辨率研究发育轨迹的研究文章的逐步推出，单细胞大样本量去进行精细的发育轨迹研究的方法也逐渐走入了人们的视野。然而转录调控网络如何在植物根系中调节其发育过程尚不清晰？拟南芥根具有固定的细胞和组织，可极大地简化细胞谱系的追踪，有利于进行器官发育过程中的基因时空表达模式的研究。虽然目前多个研究组相继报道了拟南芥根的单细胞测序图谱；但这些单细胞图谱中涵盖细胞数量较少，且鲜有对多种细胞类型的发育轨迹进行同时描述。 基于此，美国杜克大学和德国柏林洪堡大学的Shahan和Hsu等人利用scRNA-seq技术制作了拟南芥根系图谱，揭示了细胞类型分化过程中基因表达的逐渐变化和细胞命运的候选调节因子，展示了伪时间内的发育进程，并采用了最优运输的数学概念来推断细胞发育轨迹并确定其潜在的调节因子。  研究材料 野生型拟南芥幼苗主根尖 技术方法 单细胞转录组 研究路线 步骤1：根系组织的单细胞转录图谱与细胞注释； 步骤2：组织类型依赖下的单细胞发育过程； 步骤3：最优运输算法（OT）依赖的单细胞发育过程与转录调控； 步骤4：细胞身份突变体的发育分化途径； 步骤5：SCR突变层存在反分化。 研究结果 1. 逾11万个细胞的整合的根发育图谱情况 研究对13组独立生长的野生型(WT)幼苗采集5至7天大的主根尖0.5厘米的组织，分离细胞进行了单细胞转录组测序，并集合了另外三个已发表的根scRNA-seq数据集，共计将110,427个细胞整合到器官尺度图谱中。  2. 基于已知发育环境下的细胞注释 所得到的图谱排序由组织在连续分支内的细胞组成，这些分支对应于四个主要的根组织：侧根帽(LRC)和小柱细胞组成根帽并形成一个分支；毛原细胞和无毛原细胞构成表皮，形成第二个主要分支；皮层和内胚层细胞共同构成了基础组织，形成了第三个分支；韧皮部、木质部、原形成层和中柱鞘细胞形成第四个分支。韧皮部内的其他细胞类型还有：韧皮部和伴细胞;原韧皮部、木质部(原木质部和后质部)和中柱鞘(木质部极和韧皮部极中柱鞘)。 接下来，对维管细胞、表皮细胞和地面组织细胞类型进行了发育阶段注释。观察到每个主要分支的基部是近端分生组织的年轻细胞，其次是远端分生组织的，伸长的，最后是尖端的成熟细胞。  3. 通过个体组织类型推断发育过程 通过伪时间分析来更详细地分析发育过程，观察到对地面组织的共识时间注释与发育阶段注释以及已知内胚层和皮层标记物的表达相对应。根组织当中的一些发育调节因子， SCR、MYB36和CASP1的比例表达代表了内胚层细胞跨越分生组织区到早熟区的标记；地面组织标记JKD以及皮质特异性标记CORTEX和NPF6.4的表达也符合预期。将伪时间顺序划分为10组（T0-T9），产生的差异表达分析确定了在皮层和内胚层分化过程中存在连续动态表达的基因。   4. 最优运输算法分析确定了发育轨迹 接下来，课题组使用StationaryOT（一种基于最优运输的运算方法）来推断整个图谱的发育轨迹。这种新的方法所推断的发育轨迹在很大程度上独立于图谱注释，能够很好地反映每种细胞和组织类型分化的现有生物学知识。 再进一步将分化事件可以通过在质心坐标中以“三角形图”的形式投射多个命运概率来可视化，用于询问每种细胞类型的命运获取与所有其他细胞类型的关系。为了探索内胚层和皮层身份的差异，研究人员为每一种命运指定了三角形的一个顶点，第三个顶点代表所有其他可能的命运。伸长的皮层细胞有可能获得不同的命运。  5. OT分析有助于识别发育调节因子 研究人员预测每种细胞类型的命运规范概率的表达模式的TF，在排名靠前的基因中，有许多已知的调节因子对给定细胞谱系有积极影响，如MYB36和SCR用于分生组织和伸长的内胚层；JKD用于分生组织和伸长的皮层；GLABRA2, MYB23和CAPRICE用于分生组织和伸长的成毛细胞；RHD6 (BHLH83)用于分生组织的毛细胞。 6. scRNA-seq揭示细胞身份突变体的分化途径 由于SCR和SHR两个调节因子对干细胞生态位维持和组织模式形成至关重要，重点关注其数据，发现SHR和SHR突变体都缺乏不对称的细胞分裂模式，导致单一突变的组织层而不是皮层和内胚层细胞层；两种突变体的原木质部细胞丰度减少，SHR的原韧皮部和韧皮部丰度减少。表明SHR中柱鞘同一性的推定丧失。  7. scRNA-seq提示SCR突变层的反分化 计算SCR细胞命运概率:SCR皮层和内胚层细胞存在于皮层和内胚层之间的连续体上。这反映了这些细胞内胚层和皮层命运的可能性。此外，大多数分生的和伸长的SCR细胞被归类为皮层，然而，分化的SCR细胞被注释为皮层或内胚层。也就是说，年轻的SCR突变层细胞是皮质样的，而老年细胞的特征则更像内胚层，分生组织和早期伸长细胞需要SCR来表达MYB36和内胚层身份。  小编小结 为了绘制根系细胞类型和发育时间的基因表达动态，该研究团队在单细胞分辨率下建立了一个全面的根系的器官尺度图谱。采用了最优运输的数学概念来推断发育轨迹并确定其潜在的调节因子。此外，分析了两个关键转录调节因子的突变体，SCR和SHR，而SCR突变体观察到了混合细胞身份表型的组织反分化。这套研究结果支持该图谱作为丰富的数据资源，用于揭示指定和维持细胞身份以调节时空器官发育的转录程序。 |
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