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结果： SP21在CCA组织中上调表达，并与预后不良相关 人类拥有50多种USP家族去泛素化酶，使得这类DUBs成为最大的 11 。为了探索它们在CCA中的功能，作者根据TCGA数据集绘制了基于差异表达基因的热图（图1A）。然后，对人类CCA样本进行基因组分析，通过癌细胞富集的方式发现USP21在所有病例中的扩增率最高（图1B） 12 。为了确定在USP家族中对CCA发展起关键作用的基因，作者结合了TCGA和GEO数据库（GSE26566，GSE45001），探索上调基因，并在三个数据集中设定统一的标准（Log2FC>1，P<0.01）。最终，作者确认USP21是唯一一个在这三个数据集中同时高表达的基因（图1C；补充图1A-C）。然后，作者进一步验证了USP21在CCA组织中的高表达情况，使用了GES107943数据集（补充图1D）。先前的报告表明，USP21在肝细胞癌中调节细胞增殖 13 ，然而，对于USP21是否以及如何促进CCA的致癌机制尚无分子机制的了解，因此作者选择了USP21进行进一步的研究。作者通过RT-qPCR检测了50名随机选择的CCA患者中USP21的mRNA表达水平。与非肿瘤组织相比，肿瘤组织中USP21的mRNA表达水平显著上调（图1D）。随后，作者随机选择了14对样本进行了Western blotting检查，结果显示肿瘤组织中USP21的蛋白水平高于非肿瘤组织（图1E）。
为了选择适当的USP21敲低和过表达的CCA细胞系，作者通过RT-qPCR和Western blot检测了CCA细胞系中USP21的mRNA和蛋白表达水平。与正常胆管上皮相比，所有四个CCA细胞系中USP21的mRNA和蛋白表达水平都要高得多，其中，QBC939中USP21的表达水平最高，而HuCCT1中相对较低（附图2A-B）。因此，作者选择了QBC939细胞使用siRNA沉默USP21，选择了HuCCT1细胞通过慢病毒增加USP21水平。USP21的转染效率在mRNA和蛋白水平上都得到了验证（附图2C-D）。
USP21通过HIF-1信号通路增强有氧糖酵解，促进CCA细胞的增殖为了进一步探索USP21在CCA进展中的分子机制，对QBC939进行了RNA测序分析，分别处理了Si-NC和Si-USP21，以确定基因表达的变化（附图3A）。KEGG富集分析显示，USP21敲除影响了与CCA细胞中肿瘤和代谢相关的多种信号通路，其中糖酵解/糖异生和HIF-1信号通路的得分显著高于其他通路（图3A）。GO富集还揭示了多个生物合成过程（附图3B）。接下来，根据测序分析结果，作者从糖酵解/糖异生通路中选择了差异表达最大的基因ENO2、ENO3、ALDOC和ACSS2，并通过RT-qPCR验证了它们在USP21敲除和过表达CCA细胞中的mRNA表达。与测序分析结果一致，USP21敲除的QBC939细胞中ENO2、ENO3、ALDOC和ACSS2的mRNA水平显著降低，而USP21过表达的HuCCT1细胞中增加（图3B）。Western blotting结果还证实了USP21可以调节糖酵解酶的合成（图3C）。为了进一步验证作者的结果，作者检测了60个随机选择的CCA组织样本中USP21、ENO2、ENO3、ALDOC和ACSS2的mRNA水平。皮尔逊相关分析显示USP21与ENO2（r=0.6038，p<0.0001）、ENO3（r=0.5319，p<0.0001）、ALDOC（r=0.7080，p<0.0001）和ACSS2（r=0.5648，p<0.0001）之间存在正相关关系（图3D）。
为了更深入地了解USP21调节CCA细胞中HIF1A蛋白表达的机制，作者使用IP/MS（免疫沉淀结合质谱）技术检测与USP21结合的蛋白质。根据分析结果，作者确定了热休克蛋白90（HSP90），它作为分子伴侣蛋白，据报道可以直接调节HIF1A的降解 19 , 20 。因此，作者采用HSP90抑制剂17-AAG来抑制CCA细胞中HSP90的表达。值得注意的是，作者发现降低HSP90表达水平可以有效减少HIF1A的总蛋白表达（附图5A）。此外，作者还发现糖酵解/糖异生途径的关键酶烯醇酶1（ENO1）也与USP21结合（图4A）。KEGG富集分析进一步显示，碳水化合物代谢途径是显著富集的途径（图4B）。然后，作者使用敏感的银染色方法进一步确认了结合的蛋白质（图4C）。免疫荧光实验证实了USP21与HSP90和ENO1在CCA细胞中的相互作用（图4D）。接下来，进行了共免疫沉淀（co-IP）分析，以进一步确认IP/MS分析的结果。如图4E所示，USP21在QBC939细胞中沉淀了HSP90和ENO1，而未沉淀HIF1A。在HuCCT1细胞中也得到了一致的结果（附图5B）。反向共免疫沉淀证实，USP21在CCA细胞中与HSP90和ENO1有显著的沉淀作用。作者还发现，HIF1A也可以被HSP90沉淀（图4F，附图5C-D）。USP21由一个氨基末端结构域和一个C末端USP结构域组成（图4G）。为了确定USP21与HSP90和ENO1相互作用所需的最小基本结构域，将His-USP21或其截短突变体转染到HEK293T细胞中。共免疫沉淀分析显示，USP21的C末端对于与HSP90和ENO1的相互作用至关重要（图4H）。此外，作者观察到HIF1A、HSP90和ENO1的表达水平的变化与动态的USP21表达水平一致（图4I，附图5E）。根据这些结果，作者建议USP21直接与HSP90和ENO1相互作用，并通过HSP90影响CCA细胞中的HIF1A表达水平。
USP21抑制了人胆管癌细胞中HSP90和ENO1的泛素化和降解RT-qPCR结合RNA测序分析结果表明，USP21对HSP90和ENO1的调控不发生在mRNA水平上（附图6A-B），但HSP90和ENO1蛋白的稳定性可能受到USP21的调控。作者进一步研究了USP21是否可能稳定HSP90和ENO1。过表达野生型USP21增加了HSP90和ENO1蛋白的水平，而过表达催化活性失活的C221A突变体USP21没有引起这样的增加（图5A）。加入蛋白酶体抑制剂MG132逆转了USP21敲除后HSP90和ENO1蛋白水平的下降（图5B）。作者接下来研究了USP21敲除或过表达对内源性HSP90和ENO1蛋白在蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺存在下的稳定性的影响。与对照CCA细胞相比，USP21敲除CCA细胞中HSP90和ENO1蛋白的半衰期较短，而USP21过表达细胞中观察到相反的情况（图5C）。此外，在转染USP21（C221A）的CCA细胞中，HSP90和ENO1蛋白的半衰期没有显著变化（附图6C）。随后，作者试图确定USP21是否可能调节HSP90和ENO1的泛素化和降解。作者将HA-Ub转染到CCA细胞中，然后给予MG132以抑制蛋白降解。在与抗Hsp90和抗ENO1抗体共免疫沉淀后，观察到USP21敲低细胞中HSP90和ENO1的泛素化水平增加，而USP21过表达则降低了泛素化水平（图5D，附图6D）。为进一步确认USP21对HSP90和ENO1泛素化的影响，作者共转染HEK 293T细胞His-USP21（WT或C221A突变体）和HA-Ub。过表达WT USP21抑制了HSP90和ENO1的泛素化，而C221A突变体则没有这种效应（图5E，附图6E）。此外，HIF1A，HSP90和ENO1的蛋白表达水平进一步验证了先前的发现（图5F）。然后，作者将重点放在USP21对HSP90蛋白的多泛素修饰的影响上，并发现USP21会切割与Lys48相关的多泛素链，但对与Lys63相关的多泛素链没有显著影响（图5G）。为了确认Lys48连接的多泛素化对于USP21调控的HSP90降解是必要的，作者在USP21敲除细胞中表达了Lys48抗性（Lys48R）的泛素形式，并发现Lys48R泛素的表达消除了USP21敲除引起的HSP90和ENO1的降低（图5H）。基于以上发现，作者推测USP21抑制了HSP90和ENO1的泛素化和降解，去泛素化了HSP90和ENO1的K48连接的多泛素化。
USP21通过增加HSP90和ENO1水平，在人类CCA细胞中促进有氧糖酵解和肿瘤生长为了进一步验证HSP90在USP21介导的CCA进展中的作用，作者将过表达USP21的HuCCT1细胞分别用50 nM的17-AAG或DMSO处理。如图6A-B所示，在CCA细胞中，HSP90抑制剂显著逆转了USP21过表达引起的HIF1A蛋白表达的上调，并逆转了糖酵解酶基因ENO2、ENO3、ALDOC和ACSS2的蛋白和mRNA表达水平。接下来，作者观察到HSP90抑制剂逆转了USP21介导的HuCCT1细胞中葡萄糖消耗、乳酸产生和细胞ATP水平的增加（图6C-E）。功能实验包括板块克隆形成实验、EDU染色实验和CCK8实验进一步验证了HSP90抑制对USP21的拯救效应（图6F-H）。随后进行了体内实验。基于异种移植瘤的重量和体积分析显示，HSP90敲除部分减弱了USP21诱导的肿瘤生长（图6I-K）。异种移植瘤的免疫组织化学染色显示USP21过表达组中增加了增殖标记物Ki67和PCNA的表达。作者还发现，在USP21过表达的裸鼠肿瘤中，HIF1A和与糖酵解相关的标志物的表达水平较高，而HSP90抑制则逆转了这种效应（图6L，补充图7A）。
目前，基于吉西他滨的化疗仍然是晚期胆道肿瘤的一线治疗方法，并且已被证明可以改善生存率 23 , 24 。接下来，作者探讨了USP21是否影响CCA细胞对吉西他滨的耐药性。CCK-8实验显示，USP21敲除降低了CCA细胞对吉西他滨（GEM）的半数抑制浓度（IC50）（图7A）。相反，上调USP21在肿瘤细胞中诱导了吉西他滨的耐药性（图7B）。基于此，作者用不同剂量的吉西他滨（0/200/400nM）处理CCA细胞。克隆形成实验显示，USP21过表达的HuCCT1细胞在吉西他滨治疗后的存活率高于对照组细胞（图7C-D）。γ-H2AX实验显示单个细胞中DNA损伤的程度，结果显示USP21过表达减少了HuCCT1细胞中γ-H2AX焦点的数量（图7E-F）。随后，作者进一步在CCA异种移植瘤模型中证实了USP21在吉西他滨耐药性中的作用。将HuCCT1细胞皮下注射到裸鼠体内。当肿瘤直径达到4毫米时，每隔4天腹腔注射20毫克/千克的吉西他滨5次。值得注意的是，与未接受吉西他滨治疗的小鼠相比，接受吉西他滨治疗的皮下异种移植瘤的重量和体积显著减少。吉西他滨在USP21过表达组的疗效较对照组差（图7G-I）。吉西他滨治疗裸鼠异种移植瘤的H&E染色显示，吉西他滨的给药增强了细胞坏死（图7J）。总之，这些结果表明USP21在CCA细胞对吉西他滨的耐药性中起着关键作用。
高HSP90、HIF1A和USP21的表达与预后不良相关为了进一步揭示HSP90和HIF1A对USP21阳性CCA患者预后的贡献，作者对包含210例CCA患者的TMA进行了免疫组化染色（图8A-B）。CCA患者的临床病理特征与HSP90和HIF1A蛋白表达水平之间的关系见附表1-4。Kaplan-Meier生存曲线显示高表达的HSP90和HIF1A与不良预后相关（图8C-D）。此外，基于TMA免疫组化染色评分的相关分析显示HSP90与CCA组织中的HIF1A显著相关（图8E）。进一步的相关分析显示HSP90和HIF1A的蛋白表达与USP21的表达呈正相关（附图8A，附表5）。当CCA患者中USP21与HSP90或HIF1A中的任一蛋白高表达时，其OS和DFS明显较差（图8F-G）。此外，作者分析了USP21/HSP90/HIF1A的三重相关性，发现USP21/HSP90/HIF1A同时高表达提示CCA队列中的较差OS和DFS（图8H）。所有这些数据表明，USP21、HSP90和HIF1A可能是胆管癌患者的良好预后指标和治疗靶点。
总结 综合而言，USP21 驱动的有氧糖酵解可能与 CCA 细胞中的 HSP90/HIF1A 复合物或 ENO1 的直接稳定有关。在本研究中，作者证明了 USP21 通过去泛素化稳定了 HSP90 和 ENO1。此外，无论 USP21 是否与 HSP90 或 HIF1A 同时高表达，胆管癌患者的预后和总生存率都较差。总之，作者的研究结果强调了 USP21 介导的 HSP90 和 ENO1 的翻译后调控在有氧糖酵解和 CCA 肿瘤进展中的重要性，并为靶向葡萄糖代谢的癌症治疗提供了一个选择。
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