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结果： 通过病理学指导的采样策略获得的胃癌代表性单细胞转录组景观作者采用了病理学指导的采样策略，并在手术切除的胃癌标本中对14个组织进行了基于液滴的单细胞RNA测序（10X Genomics）分析，包括1个正常粘膜组织、6个分化型胃癌（DGC）组织、6个低分化型胃癌（PDGC）组织和1个神经内分泌癌（NEC）组织，所有这些组织均经过了并行的组织病理学检查确认（附表S1）。神经内分泌癌组织和相应的腺癌组织来自同一肿瘤，病理学上被诊断为混合腺神经内分泌癌（MANEC）。通过将DGC与PDGC进行比较，鉴定了癌细胞的分化特征作者比较了具有明确病理诊断的DGC和PDGC的转录组，以阐明它们的分子差异（图2A，B）。对于PDGC和DGC的恶性细胞的DEGs，CLDN3、FABP1、S100A10和PHGR1的表达在DGC中显著增高，而与上皮间质转化（EMT）相关的基因，如VIM、LAMB3、LAMC2、COL6A1和COL17A1，则特异性地在PDGC中表达，表明EMT特征在PDGC中富集（补充表S5，图2C，D和图S3A）。PDGC中富集了几个与EMT相关的术语，如聚焦粘附、对创伤的反应、正向调节细胞迁移和细胞间粘附（图2E）。与非恶性上皮细胞相比，PDGC中的上调和下调DEGs更多（图S3B，S3D）。此外，HIF1A主要在PDGC中表达，表明PDGC中可能存在更强的缺氧（图S3E）。
接下来，为了研究癌细胞分化标志与相应免疫微环境特征之间的关系，作者根据肿瘤浸润的CD8 T细胞密度将患者分为免疫贫乏型和免疫丰富型[39]。作者发现在免疫贫乏型中，恶性细胞的比例较高，这表明免疫贫乏型肿瘤中恶性细胞的密度较高，这也得到了H&E染色的证实（图3A，B）。作者在免疫贫乏型中鉴定了S100A2、CAV1、CAV2和ANXA1等标记物，以及与细胞外基质粘附、整合素相关途径和应对创伤等GO术语；而在免疫丰富型中鉴定了LAGLS4、CLDN3和PIGR等基因，以及与粒细胞迁移、中性粒细胞降解和内吞作用等GO术语（附表S7，图3C和图S4A）。此外，作者使用TCGA数据集中的MSI-H和MSI-L胃癌样本来确认免疫贫乏型和免疫丰富型之间的差异表达基因(DEGs)。预期地，在TCGA数据集中，免疫贫乏型肿瘤组织中的恶性细胞标记物在MSI-L样本中表达较高，而免疫丰富型肿瘤组织中的恶性细胞标记物在MSI-H样本中表达较高（图3D）。免疫丰富型和免疫贫乏型中的恶性细胞百分比在恶性簇中有所不同，免疫丰富型肿瘤组织中的恶性细胞富集在T1、T6和T7簇中（图S4C）。此外，作者根据免疫相关基因集分析了恶性细胞的伪时间轨迹，发现了从免疫丰富型到免疫贫乏型的恶性细胞路径，表明这两种类型之间存在连续的转变（图S4B）。
为了详细描述NK/T细胞簇以及T细胞与恶性细胞之间的关联，作者分析了所有的T细胞，并根据相应的标记将它们分为17个簇，其中包括3个NK或γ/δ T细胞簇，4个CD8 T细胞簇，6个CD4 T细胞簇和4个具有特定标记的其他T细胞簇（图4A，B）。这些簇在不同的肿瘤样本中分布相对均匀（图4C）。在这些T细胞簇中，STMN1 T细胞代表细胞周期标记，并包含CD8和CD4 T细胞（图S5A）。对于这四个CD8 T细胞簇（GZMB CD8 T细胞，GZMH CD8 T细胞，GZMK CD8 T细胞和TNFSF9 CD8 T细胞），GZMB CD8 T细胞和GZMH CD8 T细胞的细胞毒性能力比其他细胞更强，而GZMB CD8 T细胞与其他CD8 T细胞相比具有特定的疲劳标记（图4D）。作者筛选出与疲劳相关的基因，如PDCD1、CTLA4和HAVCR，这些基因主要在GZMB CD8 T细胞中表达（图S5B）。
在作者测序的这12名患者中，有2名患者患有MANEC，这被定义为一种具有经典腺癌和神经内分泌癌形态学和免疫表型特征的胃癌类型。通过形态学和免疫组织化学分析的结合，作者确定了这2个MANEC肿瘤中的三个主要组分：分化腺癌、中间状态癌细胞和神经内分泌癌。中间状态癌细胞指的是在形态学上介于分化腺癌和神经内分泌癌之间，但不表达已知的分化腺癌标记物（MUC5AC和MUC6）或神经内分泌癌标记物（Syn和CgA）的肿瘤组分，尽管在病理检查中可以被视为分化腺癌（图5A）。
巨噬细胞占据了髓系细胞的主要部分（9个已鉴定的簇，具有不同的标记基因，如FCN1、C1QA、CCL18、HSPA18、SPP1、CXCL10、INHBA、CDKN1C和MT1G），还鉴定出其他细胞簇，如CD1C DC、CCR7 DC、LTB DC、FCGR3B中性粒细胞和循环髓系细胞，根据相应的标记基因。其中，FCN1巨噬细胞和C1QA巨噬细胞占据了髓系细胞的最大比例（图6A、C）。对于巨噬细胞，使用了几个基因集，如M1极化基因集、M2极化基因集、促炎基因集和抗炎基因集，来评分巨噬细胞，所有巨噬细胞簇都倾向于表现出M2极化特征（图6B）。作者发现上述特征与代谢活动之间存在一致的正相关，如脂肪酸生物合成和烟酸相关代谢，以及与能量代谢的多样相关，如TCA循环和氧化磷酸化（图6D）。
作者研究的最有趣的发现是混合型腺神经内分泌癌中分化状态的转变。作者构建了从 DGCs 到 NECs 的所有恶性细胞的伪时间轨迹，并确定了沿着转分化路径逐渐变化的基因，表明了与 Nikolas 等人报道的小细胞神经内分泌状态的趋同性[44]。MUC1、CEACAM5 和 CLDN18 是免疫治疗的潜在靶点，它们逐渐下调，表明在这种神经内分泌分化过程中免疫攻击的逃避增加。中间状态的恶性细胞显示出 DGC 和 NEC 标记基因的双阴性特征，代表可能与胃癌进展相关的“干细胞/祖细胞”特征。与前列腺癌和非小细胞肺癌的研究类似，许多转录因子在这种转分化路径中表达差异[45, 46]。新的发现是在 DGC 到 NEC 转分化路径上发现了干扰素相关途径的负相关，同时伴随着免疫组化染色中 CD8 T 淋巴细胞浸润的减少，支持神经内分泌分化作为胃癌免疫逃避机制的一种方式，这需要在未来进行进一步的功能研究。
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