腰椎间盘退变动物模型的研究进展

杜瑞环，张  警，李忠海

大连医科大学附属第一医院骨科

腰椎间盘突出症是骨科常见疾病，指纤维环破裂后，髓核、纤维环及韧带向腰椎管突出，刺激或压迫神经根，引起患者腰、腿疼痛，病情反复，导致患者活动受限甚至残障，严重影响患者生活质量。而椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IDD）是腰椎间盘突出症的主要原因，相比于腰椎间盘突出症，腰椎IDD更为常见。有大型队列研究显示腰椎IDD发生率男性为31.6%，女性高达44.7%^[1]。建立IDD动物模型对人类腰椎IDD的相关研究尤为重要，然而IDD的机制尚不清晰，并且IDD的动物模型繁杂多样，尚无公认的统一且理想的IDD动物模型。根据人类IDD的特点，改变动物腰椎髓核和纤维环理化性质，甚至破坏椎间盘正常结构，诱导动物的椎间盘发生退变。不同的动物模型造模方法各有优劣，模拟人类腰椎IDD的影响因素存在差别，出于不同的研究目的，可以选择适应相关研究的动物模型。笔者对腰椎IDD动物模型的建立方法进行综述，为腰椎IDD的相关研究建立动物模型提供依据。

01

   IDD动物模型的物种选择及分类

鼠、兔、羊、猪、狗、猴及狒狒等多种动物被用于建立IDD模型^[2]。其中，猴、狒狒等灵长类动物双足直立行走，其腰椎间盘与人类的腰椎间盘在解剖生理上较为接近，最适合作腰椎IDD的动物模型^[3]，但其价格昂贵，并受伦理道德的约束，很少使用。与灵长类动物相比，羊、猪、狗等体型较大的动物易于获取，其腰椎间盘大小与人类的接近^[4、5]，但其为四足动物，腰椎间盘受到的生物力学压力较小，与人类的腰椎间盘生物力学存在很大差别，而且，其体型较大，对饲养环境有一定的要求，因此应用较少；鼠、兔等体型小、易于饲养、来源充足且经济成本低，应用最为广泛，但其椎间盘的生理解剖结构与人类存在一定差别。

目前，IDD模型按建立的方法分类主要包括诱发性IDD模型、自发退变模型和基因改造模型（图1）。诱发性IDD模型是指利用器械或化学试剂人为破坏纤维环、髓核、终板等椎间盘结构，从而造成IDD；或者通过改变实验动物的姿势、外部加压或破坏椎间盘之外的脊柱结构从而改变椎间盘的生物力学机制，诱导椎间盘发生退变，例如：尾部压缩模型、双足直立动物模型、腰椎不稳模型等。自发退变模型是指实验动物因年龄增长而发生IDD。随着基因工程技术的发展，通过敲除关键基因，构建出更容易自发产生IDD的动物称为基因改造动物。但其技术要求高、操作复杂，所以该领域研究相对较少。

图1  IDD动物模型的分类

02

  诱发性IDD模型

2.1  纤维环损伤模型

纤维环损伤包括两种方法，即纤维环手术切开法和纤维环穿刺法。纤维环手术切开法，造成IDD的效果显著，但对纤维环破坏面积大，极易引起髓核脱出，且操作复杂，而纤维环穿刺法创伤小，成功率高，且随着研究进展，在透视引导下经皮穿刺纤维环已成为目前常用的模型之一。此外，不同纤维环穿刺的手术入路各有优劣，经腹膜外穿刺更为直观，穿刺位置准确，但该方法创伤大，给经腹二次手术造成困难，经皮后外侧穿刺则是一种不错的选择。Ashinsky等^[6]的研究显示针刺兔腰椎纤维环12周后，椎间盘结构和生物力学发生显著变化，组织学分析显示椎间盘显著纤维化重塑和骨赘形成，椎间盘高度显著降低，各种指标都表明针刺椎间盘可以建立IDD模型。Piazza等^[7]也证实了针刺小鼠尾椎椎间盘可建立IDD模型。Lei等^[8]认为经腹入路穿刺纤维环具有较好的可视化效果，且穿刺位置准确、退变程度一致，穿刺后4周，组织学分析显示髓核中脊索细胞丢失，纤维软骨充满髓核空间，纤维环解体，并且随着时间推移，椎间盘高度不断降低，在影像学和组织学上与人类IDD一致。Moss等^[9]也介绍了一种经腹入路穿刺纤维环从而建立兔腰椎IDD模型的方法。然而，Wang等^[10]认为经腹入路手术的造模方式对实验动物创伤大，造成不必要的损伤，也不利于经前路二次手术，因此他们研发了一种经皮后外侧穿刺兔腰椎间盘建立的腰椎IDD模型，通过MRI和组织学分析确定了手术12周后可以成功建立兔腰椎IDD模型。Huang等^[11]研究发现在X线透视引导下穿刺大鼠L4/5和L5/6椎间盘6个月后可以导致腰椎间盘胶原纤维增多、髓核减少、纤维环增厚和形状扭曲，各种行为实验也提示IDD。Luo等^[12]描述了一种透视引导下兔椎间盘穿刺的微创方法，术后4周成功建立IDD模型。

通过纤维环穿刺建立IDD模型时，针头型号、穿刺深度和次数对造模效果和造模周期有重要影响。不同的实验动物选取的穿刺针型号也不同。以大鼠为造模对象时，穿刺针常用18号针头。相比于单次纤维环穿刺，采用小型号针头多次穿刺的造模效果更佳。Baldia等^[13]发明了一种新的针刺损伤的工具，使用显微镜搭配注射器，精确控制针刺深度，术后6周内椎间盘高度显著降低，IDD程度持续加重。此外，关于穿刺针头型号的选择，有学者对比了16、18和26号针头穿刺大鼠椎间盘的效果，发现椎间盘经16号针穿刺后，术后1周急剧退化；26号针穿刺对椎间盘无明显损伤；而18号针头穿刺会导致椎间盘进行性退变，从而得出18号针是穿刺椎间盘建立大鼠IDD模型的最佳选择的结论^[14]。然而穿刺针头的选择与实验动物体型也有关系。早期的研究显示16号针头穿刺新西兰兔的椎间盘，穿刺深度为5mm，24周后影像学和组织学均显示成功建立IDD模型^[15]。Xi等^[16]对比了15号和20号针头穿刺恒河猴椎间盘建立IDD模型的效果，结果显示20号针头穿刺恒河猴椎间盘诱导缓慢进行性、轻度椎间盘退变的效果更佳。Tian等^[17]指出以小鼠为研究对象，26号针头穿刺尾骨椎间盘，4周后成功建立IDD模型。关于环形穿刺和单次穿刺的效果，Kim等^[18]对比了细针多点穿刺（21号针穿刺3个点）与粗针单点穿刺（18号针穿刺1个点）的效果，结果显示两种穿刺方法均可导致IDD，但是细针多点穿刺法可产生更明显的IDD征象。此外，Tian等^[19]的随机对照实验以大鼠为研究对象，他们发现与单一卵巢切除或针刺损伤椎间盘相比，卵巢切除术和针刺损伤椎间盘联合手术诱导大鼠尾部IDD更有效，且IDD程度随着时间加重。纤维环穿刺损伤模型是一种快速、稳定且易操作的动物模型，然而这种动物模型是通过人为损伤椎间盘而建立，与人类IDD过程相比，可能涉及不同的病理生理学，因此在人类腰椎IDD的发病机制和病理生理学的研究方面，这种模型被认为不如自发的IDD模型。 

2.2  髓核损伤模型

髓核基质改变，细胞减少是IDD的主要特征，因此，通过注射化学试剂或器械损伤髓核细胞，可诱导或加速腰椎IDD形成。根据髓核损伤模型的构建原理，分为化学损伤模型和物理损伤模型。此外，向髓核注射痤疮丙酸杆菌也可诱导椎间盘发生退行性变化，然而其机制尚不清晰。

2.2.1  髓核化学损伤模型  化学损伤是指向椎间盘注射化学试剂从而对髓核造成损伤，例如碘乙酸钠和软骨素酶等（表1）。Suh等^[20]证实了向大鼠腰椎间盘注射碘乙酸钠会导致椎间盘宽度和髓核面积减小，且大鼠重量负荷转移到前脚掌、后仰减少，表现出类似IDD引起的腰痛，因此向椎间盘注射碘乙酸单钠或成为一种新的更有潜力的腰椎IDD动物造模方法。Sudo等^[21]也提出向腰椎间盘注射碘乙酸钠可以建立兔IDD模型，他们分别于注射后2、4、8、12周通过MRI检查和组织学分析椎间盘高度等指标，发现IDD呈现出时间和剂量依赖性变化。Yuan等^[22]向大鼠尾骨椎间盘注射30μL无水乙醇，诱导终板损伤，阻断椎间盘的营养供应，4个月后椎间盘高度显著降低，终板发生骨硬化，组织学与生化指标均表明椎间盘呈退行性变化。Zhang等^[23]向山羊椎间盘注射软骨素酶，12周后椎间盘炎症反应增加，IDD程度随着注射剂量增加而加重。Gullbrand等^[24]也探究了不同剂量的软骨素酶诱导IDD的程度，指出分别注射0.1U、1U或5U软骨素酶可建立轻、中、重度IDD模型。注射化学试剂的剂量可以改变IDD的程度，造模应严格控制试剂剂量。然而，当向椎间盘注射的液体体积超过阈值时，也会诱导椎间盘发生退行性变化。Mao等^[25]发现当注射到大鼠尾骨椎间盘的磷酸盐缓冲盐水达到2.5μL时，放射学、生化和组织学分析发现椎间盘表现出退行性变化，并且退变程度随着剂量的增加而加重。此外，化学试剂注射到椎间盘空间时，注射过程本身会对椎间盘造成针刺损伤，因此应当选择型号较小针头。

随着研究进展，在大部分人类IDD患者椎间盘中发现痤疮丙酸杆菌，因此，根据这一特点，向动物椎间盘接种痤疮丙酸杆菌从而诱导IDD，然而这种模型的构建机制尚不清晰，有待进一步完善。Lin等^[26]的研究显示，用带有28号针头的微注射器将痤疮丙酸杆菌接种到大鼠尾骨的髓核中，术后72h发现髓核细胞凋亡显著增加。Zamora等^[27]证明了痤疮丙酸杆菌可以诱导大鼠尾骨IDD，与对照组相比，接种痤疮丙酸杆菌12周后，椎间盘体积显著减少，退化明显。Shan等^[28]提出痤疮丙酸杆菌诱导IDD，在术后2周至9个月内多个时间点进行检查分析，发现椎间盘发生退变并且终板区出现炎症反应，且随时间推移而加重。

2.2.2  髓核物理损伤模型  髓核物理损伤模型主要是指通过髓核摘除、纤维环穿刺并抽吸髓核以及通过冰冻损伤髓核的方法建立IDD模型。Shi等^[34]使用针刺小鼠椎间盘，并在显微镜下使用微型手术刀去除髓核，术后12周内，小鼠的椎间盘进行性退变，椎间盘高度降低、髓核减少、蛋白多糖耗竭，成功建立了小鼠IDD模型。Wang等^[10]的研究显示腰椎间盘针刺损伤、腰椎间盘穿刺并抽吸髓核两种方法均可建立IDD模型，但是与椎间盘穿刺损伤相比，腰椎间盘穿刺并抽吸髓核造模效果更佳。Kim等^[18]对比了4种动物模型，以L1/2腰椎间盘作为对照，分别在兔不同节段腰椎间盘采取以下四种手术方式：L2/3处使用23号针头在椎间盘内注射喜树碱，在L3/4处使用21号针头进行穿刺并抽吸髓核，在L4/5处使用21号针头进行3次穿刺，在L5/6处使用18号针头进行1次穿刺，结果显示与对照相比，穿刺并抽吸模型的硫酸糖胺聚糖含量显著降低，诱导腰椎IDD效果最佳。Flouzat-Lachaniette等^[35]则通过终板穿孔进行髓核冷冻损伤来诱导IDD，他们以猪为研究对象，与椎间盘穿刺或仅终板穿孔而未冷冻损伤的方法相比，经终板穿孔髓核冷冻损伤后椎间盘高度显著更低，椎间盘脱水率也显著更高，IDD也更严重。

2.3  终板损伤模型 

椎间盘主要通过终板提供营养物质，因此通过损伤终板，减少椎间盘营养供应也可以诱导IDD。Su等^[36]报告了一种通过椎体炎症来诱导IDD的动物模型，他们通过随机对照实验发现，大鼠椎体中部钻孔填充脂多糖可以诱导终板退变，椎间盘高度显著降低，髓核基质改变，纤维环结构杂乱无章。Wei等^[37]提出一种终板损伤动物模型，通过减少椎间盘的营养供应，从而诱导椎间盘退变，利用骨髓针向兔椎间盘附近的软骨下骨中注射平阳霉素，术后3个月时髓核基质金属蛋白酶3等指标都显著增加，提示IDD，术后6个月时椎间盘间隙显著变窄。此外，Wei等^[38]使用同样的方法，利用博来霉素建立了恒河猴腰椎IDD模型。Jin等^[39]提出一种缺血诱导IDD的模型，通过手术结扎兔腰椎节段动脉从而诱导终板缺血变性，间接减少椎间盘的营养物质供应，术后2周，影像学检查证实腰椎IDD模型构建成功，组织学分析和生化分析也显示椎间盘结构受损。

2.4  机械力学模型

2.4.1  尾部压缩模型  人类的IDD与椎间盘长期承受较大压力有关，因此根据这一特点，使鼠尾骨椎间盘持续承受较强的压力，从而诱导尾骨发生IDD，这种方法操作简单，可重复性好。但是鼠尾椎椎间盘与人腰椎椎间盘解剖结构、体积大小相差甚远，不适于进行相关生物治疗研究。Yurube等^[40]证实了带有弹簧的Ilizarov装置对大鼠尾巴施加轴向力，静态压缩尾骨椎间盘，可以诱发大鼠尾骨IDD。Liu等^[41]对小鼠尾部进行2mm宽的环切后，用端端吻合的方法压缩缝合缺损处，从而增加尾骨椎间盘的压力，术后1、2、4周进行放射学检查和组织学分析，发现椎间盘的含水量在加压2周后显著下降，髓核体积减小，脊索细胞数量减少。Ji等^[42]设计了一种尾部模型，通过静态弯曲尾骨8~10椎骨，施加不同的外力压缩，14d后发现静态弯曲联合外力压缩可以诱导IDD，并且IDD程度与压缩负荷大小成正相关。这种模型强调了机械负荷对IDD的影响，实验动物易获取，操作简便且造模时间较短。

2.4.2  双足直立动物模型  双足直立动物模型是指截去大鼠前肢、利用动物疏水性、前肢支配神经切断，或者使用特殊的仪器强迫动物模拟人类直立行走，通过增加轴向负荷诱发或促进动物腰椎IDD，这种模型主要展现了重力对人类IDD的影响。Goff等^[43]最早提出截去大鼠或小鼠的双前肢后，迫使大鼠必须依靠仅有的双后肢站立才能取到食物，由此改变脊柱的受力，建立的双足动物的腰椎承受的重力负荷明显增加，从而构建腰椎IDD模型。然而这种方法对动物造成较大的创伤，不利于饲养，因此便衍生出很多其他双足动物模型。Ao等^[44]利用小鼠怕水的特性，将实验组的小鼠置于有限的含水空间，诱导小鼠主动采取双足站立姿势，每天进行两次，共6h，干预10周后，与对照组相比，试验组小鼠腰椎间盘高度下降，IDD病变程度增加，但是，与老年小鼠相比，该模型小鼠纤维环和关节突关节退变，而髓核组织退变较轻，因此尽管这种模型的小鼠用于人类椎间盘病理生理研究可能存在一定缺陷，但是这仍然是一种无创且有效的双足小鼠模型。Liang等^[45]设计了另一种改良的双足小鼠模型，通过切断臂丛神经根从而模拟人体直立姿势。Bai等^[46]将兔放入专门设计用于强制保持直立姿势的管中，并戴上项圈以增加腰椎间盘的压力，14周后成功建立兔腰椎IDD模型。Lao等^[47]研发了一款底部可以加热的笼子，通过底板高温诱导小鼠直立，增加脊柱轴向生物力学负荷，1个月后小鼠出现椎间盘高度降低、软骨终板骨化，3个月后小鼠腰椎IDD的组织学和生化标志物更加显著。

2.4.3  腰椎不稳模型  腰椎不稳模型是指手术破坏除椎间盘以外的脊柱支持结构，或者进行椎体间融合，打破腰椎稳定的生物力学环境，通过腰椎不稳来诱导或加速椎间盘的退变。Liu等^[48]报告了一种腰椎不稳定的小鼠模型，手术暴露L3~L5棘突，分离棘旁肌肉、切除关节突和韧带，术后1周L4/5椎间盘开始出现退行性变化。Oichi等^[49]通过手术切除小鼠腰椎小关节、棘上韧带和棘间韧带来建立腰椎不稳定模型，通过影像学分析发现，术后2周椎间盘高度开始下降，12周内持续下降，组织学分析同样表明腰椎呈现IDD。Fu等^[50]则切除8周龄小鼠的棘突、棘上韧带和棘间韧带，从而建立腰椎不稳模型，术后8周内多个时间点观察分析，发现椎间盘高度持续降低，基质成分、形态发生改变，细胞凋亡增加，感觉神经向退化的椎间盘生长。Hei等^[51]的研究，以新西兰兔为研究对象，透视引导下用针经皮穿刺L3/4椎间盘，直至发生退变后切除L3/4椎间盘，并进行椎体间融合，分别于4、8、12周对腰椎融合手术的相邻椎间盘进行影像学检查，发现相邻节段IDD程度随时间增加而加重。Wang等^[52]则以羊为研究对象，行L3/4椎间融合，与对照组相比，固定6周和26周的羊椎间盘高度显著降低，组织学分析表明相邻节段的椎间盘发生显著退变，然而固定6周和26周IDD没有显著差异。腰椎不稳模型是一种缓慢进展的IDD模型，虽然造模所需时间较长，但这种模型未直接损伤椎间盘，椎间盘具有完整的纤维环且没有急性损伤，更接近人类腰椎融合手术后发生相邻节段IDD的情况。

03

自发退变模型

自发退变模型是指不经特殊处理，实验动物在成长发育过程中自然发生IDD，这种模型可避免人为操作因素的干扰。这是一种缓慢进展的IDD模型，与人类IDD相似，相比于其他造模方式，以其为模型对IDD机制和治疗进行研究则更令人信服。然而这种造模方式缓慢，耗费时间过长，且动物之间性状差异明显。Ohnishi等^[53]对49只C57BL/6小鼠随访观察，采用MRI检查和组织学分析的方法评估小鼠的腰椎IDD程度，结果显示小鼠腰椎IDD程度随年龄增长而加剧，14个月大的小鼠会发生轻度IDD，22个月大的小鼠会达到中度至重度的IDD。Zhang等^[54]对比了22个月大和6个月大SD大鼠的椎间盘，老年大鼠椎间盘的钙化层比例显著增加，髓核中的水和糖胺聚糖含量减少，出现明显的IDD。Choi等^[55]研究了SM/J小鼠的早发性自发性IDD，他们发现8周内髓核细胞逐渐减少，基质成分也发生改变，17周时IDD程度明显加重。一项纵向研究对22只沙鼠进行统计评估，跟踪个体动物至12个月大，研究结果显示在部分沙鼠2个月大时，影像学上就会出现IDD的征象，12个月大时，所有腰椎部位都出现终板钙化，大多数沙鼠出现椎间盘狭窄和楔形病变^[56]。Bouhsina等^[57]探究了绵羊腰椎间盘年龄相关自发性退变的发展，他们选取了8只年轻母羊（<48个月）和4只骨骼成熟母羊（>48个月），发现随着年龄增加，绵羊椎间盘高度降低，IDD程度显著增加，且绵羊腰椎间盘与人类相似，因此绵羊腰椎间盘自发退变模型可以作为研究人类腰椎IDD机制的一种良好选择。

04

基因改造模型

基因改造模型是指通过基因技术敲除实验动物的特定基因，造成椎间盘特定成分合成、代谢异常，从而诱导IDD。这种模型同样未对椎间盘造成人为因素的损伤，发生退行性变化的椎间盘仍保留完整的纤维环，但是其实验条件要求高、操作复杂、成本高，不适宜大量使用。Hey等^[58]证实了通过敲除小鼠TSC1基因可以建立椎旁肌肉减少症模型，并且脊柱会出现受肌肉减少症影响的一系列表现，其中包括IDD，与对照组相比，9个月大的TSC1基因敲除小鼠可以观察到IDD，与椎间盘楔形病变相一致；12个月大的TSC1基因敲除小鼠椎间盘高度显著降低。Sahlman等^[59]设计了一种Col2a1基因敲除的小鼠，与正常小鼠相比，Col2a1基因敲除小鼠的终板和椎骨中的糖胺多糖含量降低，出现与人类IDD相似的特征。Hamrick等^[60]对敲除GDF-8（肌肉生长抑制素）基因小鼠进行研究，发现敲除该基因可导致椎间盘蛋白多糖含量降低和终板骨化等IDD征象。Beierfuβ等^[61]发现APOE基因敲除的新西兰兔会发生高脂血症，胆固醇和甘油三酯水平升高，导致腰动脉发生动脉粥样硬化并阻塞，从而促进腰椎间盘变性。最近，Beierfuβ等^[62]进一步的研究表明APOE基因敲除的家兔椎间盘表现出选择性炎症分解代谢因子的积累，进而发生退变，这类似于人类晚期IDD分解代谢和合成代谢的不平衡，因此，APOE敲除的家兔有希望成为腰椎IDD模型。目前，已发现多种基因改造IDD模型，通过敲除特定基因，导致实验动物异常的生长发育，或发育成熟后由于基因功能缺陷，导致椎间盘发生退变，然而生物体是一个复杂的整体，可能会通过自我调节来代偿缺失基因的功能。因此，基因改造模型的IDD程度尚不能实现自由调控，有待进一步研究。

05

总结与展望

根据人类IDD影响因素的特点，通过不同的方式建立IDD动物模型，然而这些模型建模方法、时间、动物选择以及适用的研究都有很大的区别，纤维环穿刺模型较为常见，纤维环穿刺并抽吸髓核效果更好，而自发退变模型则更符合人类IDD的过程，但动物椎间盘自发退变所需时间过长。基因改造的IDD模型则所需技术复杂，目前并没有广泛应用。良好的动物模型应该具有操作简单、可再现人类IDD过程、动物解剖与人类腰椎相似、腰椎生物力学环境与人类一致、模型重复性好、造模时间短和成本低等特点。然而，目前尚未发现理想的动物模型，但这并不影响IDD动物模型的研究价值，根据不同的研究需要，可以选择不同的模型。

doi：10.3969/j.issn.1004-406X.2023.09.12

中图分类号：R681.5

文献标识码：A 

文章编号：1004-406X（2023）-09-0847-07

基金项目：

辽宁省自然科学基金面上项目（2022-MS-322）；

大连市科技创新基金应用基础项目（2022JJ12SN045）；

大连理工大学辽宁省微纳米技术及系统重点实验室开放课题基金资助项目（20210101）

第一作者简介：

杜瑞环，男（1997-），硕士研究生在读，研究方向：脊柱退行性疾病发病机制与再生修复

通讯作者：李忠海