【原】从深海微生物的基因组信息中发现许多未知的糖酵解酶组 证实了深海微生物资源在新型酶探索中的有用性

从深海微生物的基因组信息中发现许多未知的糖酵解酶组 证实了深海微生物资源在新型酶探索中的有用性 新闻发布会 2024.05.10 JAMSTEC国立大学法人东京大学国立研究开发法人理化学研究所 国立研究开发法人海洋研究开发机构 国立大学法人东京大学 国立研究开发法人理化研究所 1 .发表要点 通过对深海沉积物的元基因组分析，发现了极新型的糖分解酶(β-N-乙酰半乳糖苷酶)。 并且，根据得到的知识进行了公共蛋白质数据库的大规模再分析，结果发现了4个新酶团体。 对新酶组进行了详细的分析，解开了这些酶获得各种功能的进化过程。 这一成果有望波及到以产业应用于医疗领域等为目标的酶的分子设计和含β-N-乙酰半乳糖胺的糖链的生物学功能的阐明等。 深海环境中的微生物由于其采样难度，研究案例非常有限。 本研究是深海微生物在探索未知有用基因方面被证实是有前景的遗传资源的好例子。 2 .概要 国立研究开发法人海洋研究开发机构(理事长大和裕幸，以下称为“JAMSTEC”。 )海洋功能利用部门生命理工学中心的澄田智美副主任研究员、平冈聪史研究员等，与东京大学的伏信进矢教授、理化学研究所开拓研究总部的石渡明弘专职研究员等、横滨市立大学、西澳大利亚大学共同，以在深海生存的微生物群落的元基因组信息和从中获得的线索为基础， 发现了作用于含β-N-乙酰半乳糖胺(β-GalNAc )糖链的4个新酶组，并对该酶组进行了详细的功能分析和分子进化机制。 本研究以新型酶探索的对象，着眼于在远离陆地的深海环境中生存的微生物群。 适应深海极限环境的微生物具有与生活在地上的微生物完全不同的独特特征，深海微生物群的元基因组信息是有望作为具有未知性质的新型酶的探索对象的基因资源。 但由于深海微生物采样存在技术困难，过去的研究案例在世界范围内也很有限。 研究小组以JAMSTEC采集的深海沉积物为对象，通过元基因组分析和生物信息学分析探索了含β-GalNAc糖链的分解酶β-N-乙酰半乳糖苷酶。 结果发现了氨基酸序列和基质特异性与已知酶大不相同的新型酶。 接着，以新酶的特征序列信息为基础，将搜索范围扩大到公共蛋白质数据库后，发现了跨越细菌、古细菌、真核生物普遍存在的4个新酶组。 此外，它还分析了这一系列新酶组的功能和蛋白质的立体结构，阐明了含有已知酶的5个酶组在进化过程中是如何获得各种功能的。 本研究成果不仅可以阐明含β-GalNAc糖链的生物学功能，将来也有望应用于具有新功能的酶的人工设计和利用新型酶的产业应用。 本成果于5月10日(日本时间)刊登在“Nature Communications”上(开放存取)。 另外，本研究的一部分用于科研经费资助事业( JP20K15444，JP22K05398 )、制药等尖端技术支持基础平台( BINDS )的支持(课题编号JP22ama121001 (支持编号3118 )、以及公益财团法人水谷糖质科学振兴财团的研究资助 论文信息 标题 genetic and functional diversity ofβ- n-acetylgalactosamine-targeting glycosidases expanded by deep-sea meta genome analysis 作者 澄田智美1、平冈聪史1、臼井圭子1、石渡明弘2、仙石彻3、Keith A. Stubbs4、田中克典2、5、出口茂1、伏信进矢6、布浦拓郎1 所属 1 .国立研究开发法人海洋研究开发机构 2 .理化研究所 3 .横滨市立大学 4 .西澳大利亚大学 5 .东京工业大学 6 .东京大学 DOI 10.1038/s41467-024-47653-2 论文公开日 日本时间2024年5月10日 3 .背景 地球上的所有生物都利用糖相关酶(糖转移酶和糖分解酶等)合成分解细胞内外各种各样的复合糖质(多糖、糖脂、糖蛋白等)，从而驱动着各种各样的生命现象。 但是，相对于复合糖的多样性，糖相关酶的功能分析绝对不足。 探索具有新功能的糖相关酶，阐明其各种性质，对阐明该酶介导的生命现象很重要。 另外，糖质相关酶还被用于以食品医疗为首的各种产业领域，如功能性低聚糖的生产、糖链结构分析、疾病诊断的利用等。 因此，探索新的糖相关酶在基础科学和应用科学两方面都很重要。 β-N-乙酰半乳糖胺(β-GalNAc )是复合糖的一种，含β-GalNAc的复合糖也广泛分布于自然界，在细菌古细菌真核生物中，存在着细胞间识别、黏附感染等相互作用、信息传递、免疫应答等多种生物学应答 作为通过分解含β-GalNAc的糖链来调节功能的酶，已知有β-N-乙酰半乳糖苷酶(β-NGA )，但直到今天，在陆地环境(土壤和人类肠道)中只研究了来自细菌的3种酶。 但是，考虑到含β-GalNAc糖链的多样性和存在量，以及这些糖链参与的生命现象的重要性，认为自然界中存在很多未知的β-NGA是妥当的。 所有已报道的酶都是基于氨基酸序列对糖相关酶进行分类的数据库( carbohydrate-active enzymes database； CAZy database )中，糖分解酶家族123(GH123； 被分类为Glycoside Hydrolase Family 123 )。 分类为GH123的β-NGA，在功能上也只登记了仅切割含β-GalNAc糖链非还原末端单糖的单糖游离型酶，未发现切割糖链内部的低聚糖游离型酶(图1 )。 含β-GalNAc的糖链不仅在陆地环境中，在海洋环境中，例如微生物的胞外多糖和鱼贝类的不可食部中大量含有的硫酸软骨素中也含有。 然而，海洋环境中β-NGA介导的生命现象直到今天还没有被作为研究对象。 因此，从海洋环境中探索具有新功能的β-NGA并鉴定其功能，对于全面理解自然界中β-GalNAc介导的生命现象也很重要。 因此，本研究利用深海微生物群的元基因组信息，探索了作用于β-GalNAc的新型糖质分解酶。

4 .成果 在本研究中，使用深海调查研究船“Eline”( 2022年2月退役)和大深度小型无人探测器“abismo”( 2017年5月丧失)，以在伊豆小笠原海沟水深5，747 m处采集的深海堆积物为对象进行了元基因组分析※1，实施了从得到的序列信息中探索β-NGA基因的生物信息学分析。结果得到了氨基酸序列与已报道的单糖游离型β-NGA大不相同的新酶的候选序列。 制作来自该序列的酶并进行活性测定的结果，不仅显示了已报道的GH123的酶所显示的单糖游离型的活性(图2a )，还显示了也能作用于糖链内部的β-GalNAc的低聚糖游离型的活性(图2b )。 由于到目前为止还没有发现低聚糖游离型的β-NGA，这是从深海元基因组信息中发现新功能酶(低聚糖/单糖游离型的β-NGA )的成果。

虽然新酶和已报告酶的氨基酸序列整体上有很大不同，但作为两者较弱共同的部分区域，存在由约70个氨基酸构成的功能未知区域( DUF4091； 域名解锁功能4091 )标题。 以这个DUF4091为线索，从公共蛋白质家族数据库Pfam中探索新酶候补序列时，从细菌·古细菌·真核生物的所有生物中获得了很多序列。 这与已报道的GH123酶组主要仅由来自细菌的序列构成形成了鲜明的对比。 使用得到的740个序列进行了大规模的系统分析，得知含有DUF4091的序列包括已报道的酶组在内，大致分为5个系统( Group 1〜4和GH123 ) (图3a )。 从各组中选择几个序列进行酶活性测定，发现各组功能有明显差异。 因此，通过使用x射线晶体结构分析※2的方法调查酶的立体形状，综合分析了酶的功能和立体结构(图3bf )。 立体结构分析所需的数据收集是在大型辐射光设施SPring-8的BL32XU※3中，利用全自动数据收集系统ZOO※4和自动管线NABE※5进行的。 比较各组酶的功能和立体结构，Group 1酶为不游离单糖、只游离低聚糖的严密寡糖游离型β-NGA，为5个系统中最简单的形式(图3b )。 与Group 1的酶相比，Group 2〜4和GH123的酶在酶切糖的位置(图3bf的剪刀所示的部分)的周边存在各种各样的附加结构和附加环(图3cf的各色所示的部分)。 Group 2酶是低聚糖和单糖都可以游离，另外，不仅是β-GalNAc，β-GalNAc的立体异构体β-N-乙酰氨基葡萄糖也可以游离的低聚糖/单糖游离型β-六氨基葡萄糖酶 Group 3的酶是同时游离低聚糖和单糖的低聚糖/单糖游离型β-NGA (图3d )。 从深海元基因组信息中发现的酶也包含在这个Group 3中。 Group 4的酶是只能游离单糖而不能游离低聚糖的严密的单糖游离型β-NGA (图3e )。 已报道的GH123酶也和Group 4一样，是单糖游离型β-NGA (图3f )。

这种酶组之间的功能差异可以从酶的蛋白质的立体形状来解释(图3、图4 )。 也就是说，Group 1、2、3的低聚糖游离型酶，由于在酶的表面具有沟一样的裂缝结构( plate结构) (图4a )，长的低聚糖结合，切断糖链内部的靶糖(图4中黄色所示的糖)，可以游离低聚糖 另一方面，在Group 4、5中，由于氨基甲酸酯结构的单侧(图4b的浅灰色部分(氨基甲酸酯)的左侧)被附加环(图4b的蓝色所示的结构)堵塞，成为只能进入糖链末端的口袋结构，因此仅切断末端的单糖 这些低聚糖游离型酶和单糖游离型酶的糖结合部位的不同，是由于只有十几个氨基酸的序列的插入引起的。 如上所述，酶的功能(基质特异性)有很大不同，但从NMR (核磁共振)※6分析中得知，这5个系统的酶组都在同一催化反应机制下分解糖。

通过比较一系列酶组的功能和立体结构，我们预测了作用于β-GalNAc的酶的功能多样化的分子进化历史(图5 )。 作用于β-GalNAc的酶的起始原酶属于Group 1，由于基因序列的变异积累，现在可能已分支为5个系统。 此外，除了基因的变异之外，还发生了基因的插入，结果认为该酶的功能有可能与低聚糖游离型酶、低聚糖/单糖游离型酶、单糖游离型酶多样化(图5 )。

用语解说 ※1 元基因组分析 一种从含有多种原核生物种类的菌群中直接提取DNA，进行基因组测序和信息分析，不经过分离培养就进行基因组分析的方法。 ※2 x射线晶体结构分析 这是决定蛋白质等生物分子立体结构的方法之一。 这是一种制作对象分子的结晶，通过分析对该结晶照射x射线得到的衍射数据，在原子水平上详细分析蛋白质立体结构的方法。 ※3 大型辐射光设施“SPring-8”及束线“BL32XU” SPring-8是位于兵库县播磨科学公园都市的可以产生世界最高性能放射光的大型放射光设施，名字来源于Super Photon ring-8 GeV(80亿电子伏)。 是向国内外产学官的研究者等开放的共同利用设施。 BL32XU是以从结晶尺寸10 μm以下的微小晶体收集衍射强度数据、结构分析为目标而设计的，是可以实现微小晶体结构分析的光束线。 ※4 ZOO系统 从蛋白质晶体自动收集x射线晶体结构分析所需的高质量数据的系统。 通过该系统，任何人都可以自动、轻松地利用辐射光设施收集蛋白质的高分辨率数据。 ※5 NABE系统 针对利用ZOO收集到的大量衍射数据，可以自动实施简易的结构分析并对结果进行观察比较的系统。 可以按数据显示用户指定的位置周边(化合物结合部位等)的电子密度图和模型，进行结构比较。 例如，可以迅速判别能否导入化合物等结果，因此可以高效地选择符合目的的最佳数据。 ※6 数字管理资源( NMR )； 核磁共振)分析 观测静磁场中放置的原子核的共鸣，调查分子的结构和运动状态等性质的光谱学分析法。 包括将分子溶解在溶剂中进行测量的溶液NMR分析和测量固体状态分子的固体NMR分析等，可以测量和分析广泛状态的试样。 五.今后展望 本研究获得的一系列新酶组功能结构分析的结果，对以阐明含β-GalNAc糖链的生物学功能和产业应用展开为目标的酶设计等今后的研究有帮助。 另外，本研究是表明了与陆地不同的极限环境深海的元基因组信息对探索新酶有用的成果。 约占地球表面70%的海洋的平均深度为3，700 m，其中水深200 m以上的深度称为深海(图6a )。 深海是黑暗、高压、低温的极限环境，但实际上各种各样的深海生物生存着，经营着生态系统。 其中，微生物在进化过程中制定了适应深海环境的独特生存战略。 因此，深海微生物有望沉睡许多与陆地大不相同的未知蛋白质，在探索具有新功能和新序列的酶方面是有魅力的微生物资源(生物资源)。 JAMSTEC目前以促进深海微生物的产业利用为目标，开展向外部机构提供JAMSTEC拥有的深海生物资源(图6b、深海堆积物和深海微生物)的深海生物资源提供事业( https://www.jams tec.go.) 另外，在深海环境中，观察到了与陆地环境明显不同的微生物群落结构，已知微生物的基因结构也有很大的不同。 深海微生物群的元基因组信息中，也含有很多深海环境固有的微物、难以培养的未培养难培养系的细菌信息，因此深海元基因组信息蕴藏着作为有用的遗传资源的可能性。

以从这次研究中得到的成果为基础，面向今后产业利用，计划与株式会社糖链工程研究所( GlyTech，Inc )共同实施研究，证实新型酶的有用性。 另外，在这次的研究中，我们从使用了1个地点的堆积物周围核的元基因组分析中进行了功能酶的探索，今后将通过大规模利用各种海域深度的元基因组信息，致力于探索有望应用于产业利用的更加多样化的功能酶。 本研究的咨询方式 国立研究开发法人海洋研究开发机构 海洋功能利用部门生命理工学中心 副主任研究员澄田智美 新闻发言人 国立研究开发法人海洋研究开发机构 海洋科学技术和战略部新闻办公室 东京大学研究生院农学生命科学研究科农系 事务部总务科总务小组总务宣传信息干事(宣传信息干事) 国立研究开发法人理化研究所 宣传室新闻发言人