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对病毒的感染性有不利影响的最主要环境因素是温度，大多数病毒耐冷不耐热，对热不稳定。使用前在无菌条件下封装病毒，直接置于液氮中速冻后存于-80℃冰箱保存，或直接放置在液氮温度（-196℃）则可更长时间保持其感染性。使用过程中，也可以暂时存放于-4℃冰箱，存放1周内，病毒滴度不会有很明显的变化。因此，为保存病毒，保持其感染性，应尽快低温冷冻，并且避免不必要的冻融，特别是反复冻融，反复冻融可使病毒大量灭活。  仪器准备  脑立体定位仪安装与使用：①将底板取出置于水平桌面上，将支撑杆插人底板，并用锁紧螺丝锁紧；②将U形导轨组件安装于支撑杆上，并用锁紧螺丝锁紧；③选择小鼠适配器，将适配器安装于导轨组件上；④将支座组件套入到导轨上，并用锁紧螺丝进行锁紧；⑤将二维操作臂安装在支座组件上，使下方的“0”刻度线与支座组件上的竖线对齐，可通过弯头锁紧螺丝进行锁紧；⑥选择适合小鼠的耳杆放入适配器两侧卡槽，把夹持器固定于二维操作臂上。注意脑立体定位仪经搬动或长期不用后，使用前需先加以效验。玻璃电极的拉制或选择应注意长度和直径，过于细长的玻璃电极在实验中容易断，且通畅性较差，过于短粗的玻璃电极可能造成容量不够或石蜡油渗漏，长度在1.0~1.3cm是比较适宜的。脑立体定位进样器制备完成后应观察确保内部无气泡，另外，需检查通畅性，可竖直放置1分钟以上，观察是否有石蜡油从针头处渗漏，固定在夹持器上，连接微量注射泵，吸少量生理盐水，在泵出，检测进样器的通畅性，若泵入和泵出通畅，则可以使用。 冷光源：打开开关即可使用，旋钮可调节合适光强。
南京卡尔文公司研发的小动物手术工作站把麻醉机、呼吸机、冷光源、手术台、体温监测集成在一个设备上，各设备使用协调性好，操作方便，不占用空间，外观精美，可完全解决实验桌台杂乱的痛点 脑立体定位病毒注射 麻醉、保定 麻醉：小鼠称重后腹腔注射1%的戊巴比妥（剂量为80mg/100g体重），放置于饲养笼内5~10min，待小鼠完全麻醉后，将小鼠头部毛发剃除干净。用干净棉签给小鼠涂少许红霉素软膏，保护小鼠眼球。麻醉还可用气麻机，麻醉不可过量防止动物死亡。若用麻药可根据实验时程补充，或者吸取少量异氟烷闻给小鼠几秒（长时程手术），切记不可过长。 将小鼠置于适配器上，在小鼠下面垫2块纱布以达到保暖的目的。将小鼠上门齿卡在适配器的孔内，轻轻压上门齿夹横杆，扭紧螺丝，注意松紧适宜，否则会影响呼吸，上下调整适配器高度，以及前后调节适配器位置，使耳杆固定在两侧颞颌关节处，左手托起小鼠头部，将左侧耳杆固定在小鼠左侧颞颌关节，接着将右侧耳杆也固定在小鼠右侧颞颌关节，注意调节左右两侧耳杆使动物头部保持在两侧耳杆正中位置，且小鼠两耳间连线与耳杆在同一直线上，先锁紧固定一侧耳杆，后旋紧另一侧耳杆，在各个方向推压小鼠头部均不能晃动。注意调整耳杆时不能用力过大，导致刺破颅骨。保定效果检查：鼻对正中，头部不动，提尾不掉，目测头顶位置水平。 暴露头骨：依次用2%碘伏和75%酒精对头顶皮肤进行消毒，之后用眼科剪沿矢状缝剪开颅顶部皮肤（长约1cm），去除颅骨表面的筋膜、肌肉及骨膜并用双氧水清洁，暴露出前囟、后囟，以前囟作为三维坐标系的参考点。 确定标准参考点： 以前囟为零点，可蘸取少量墨水协助定位。将脑立体定位进样器针头置于前囟点位置后坐标归零，先调整颅骨左右两侧平行：调整水平轴（X轴）左右坐标2.2mm处，两侧深度（Z轴）不超过0.02mm（≤0.02mm）；再调整前囟和后囟在同一水平位置，前后轴（Y轴）深度同样不超过0.02mm（≤0.02mm）。在坐标调整过程中每次调整后都回到零点，以此为参考点重新定位。当左右和前后两平面均满足条件后，即可以此时的前囟为标准零点定位目标核团，若目标脑区的位置距后囟较近，则也可以后囟为标准参考点定位。 确定目标核团、开颅钻孔：通过标准参考点，移动操作臂至目标核团的位置，可滴1滴生理盐水在颅骨表面标记，移开进样针，用颅骨钻在颅骨表面标记处钻孔开颅。注意事项：①不能用力过快过猛导致钻头进入脑内伤及脑组织（如果此过程出血，可用小的医用棉球将血吸走）；②颅骨钻孔打开后，要用1ml注射器针头把硬脑膜挑破，否则进针时会造成硬脑膜下大片出血。 病毒注射：①清洁针头：将棉签用生理盐水浸湿后擦洗玻璃电极2~3次，确保针头清洁。②吸取病毒：调节微量注射泵的参数，以不超过70nL/min的速度吸取病毒，根据实验需要吸取比注射量多20~30nL的病毒，注意针头完全浸没在病毒液面下，否则会造成误差。同时调整显微镜，使视野聚焦在针头上，观察病毒液面上升的情况，确保已经吸取到病毒，结束时停留10s，确保病毒完全吸取上来。③注射病毒：移动操作臂再次定位至目标核团的位置，微调注射器位置与之前钻孔时位置相同，调整Z轴经颅骨钻孔处缓慢下针至目标核团的位置，调节微量注射泵的参数，注射剂量少于吸取的病毒量，以不超过40nL/min的速度注射病毒，注射过程中，通过显微镜观察针头中病毒液面的变化。注射完成后，留针10min，最后缓慢抽出针头。④清洁针头：注射完毕抽出针头后，继续用微量注射泵打出剩余的病毒，用生理盐水浸湿棉签反复擦洗针头，清洁针头，避免针头堵塞。可用生理盐水一滴液封，防止血块凝结。 病毒注射的注意事项有：①注意吸取病毒时不能把石蜡油滴入病毒液中导致病毒污染；②注射病毒时不能将石蜡油注射到脑组织中，否则会导致脑组织坏死；③病毒注射的速度不能过快，且注射过程中在显微镜下观察液面变化（石蜡油与病毒密度不同，可观察到分界液面），确保病毒注射到核团中；④注射完成后留针10min，缓慢抽出针头，一方面让病毒扩散；一方面防止病毒随着针拔出而漏出核团；⑤吸取病毒前和注射完成后都要用生理盐水清洗针头，避免污染。每次病毒注射前空打10-30nL，确保能正常打出。 缝合、动物复苏 操作完成后用医用缝合线缝合皮肤，再用碘伏对创口及其附近进行消毒；将小鼠从脑立体定位仪上取下，放置于饲养笼内（可置于电热毯上或在旁边放置电暖器），待其苏醒。为防止小鼠舌后坠窒息死亡，可将舌头拉出偏一侧放置。 脑立体定位坐标参数的校正 荧光、有色染料预实验：在病毒注射之前，为了确定核团定位是否正确，推荐注射神经顺行示踪的DiI染料，注射后1周用神经逆行示踪的荧光金染料，注射后2周切片，并对照图谱确认注射的核团位点无误，再进行病毒注射，可有效提高病毒标记的成功率。冰冻切片时注意，先从所要核团外开始切（还不到核团所在层面），拿到的切片对照图谱中的一些参照物来判断核团是否准确（对照物可选大而清晰的海马、视交叉，脑室、核团附近的特殊结构如纤维索等），切片同时注意调节角度，使切片角度与图谱一致，脑切片厚度在200μm。平时在练习脑立体定位注射技术的时候，也可以注射品红等染料后直接切脑片观察注射位置。 埋光纤及行为学等测试 为了在自由活动的动物中实现对神经元的光遗传学操作，研究人员在特定脑区事先使用病毒转染的方法特异表达光遗传学效应器后，再使用光纤系统利用激光脉冲激活或沉默这一脑区。脑立体定位病毒注射2周后埋光纤：将光导入研究的区域，比如采用导入光纤或者控制激光来实现，通过选择不同参数（波长、光强度、频率）光照进行刺激，对神经元进行精准的时间和/或空间调控。导入光纤也是用脑立体定位注射仪进行操作，按照核团坐标定位到相应位置，插入光纤。光纤的直径大约200um，它足够细，不会对动物造成太大伤害，但可以有效激活光纤前端大约1mm3区域内表达了视蛋白的神经元，因此，插入光纤的深度（Z轴）较坐标浅0.5mm。1周后配合电生理记录或行为学手段等实验方法，观察和记录光刺激后的神经元变化、神经环路或动物的行为学变化。 小动物手术工作站详解介绍  技术参数： 气体流量调节范围：0~500ml 麻醉输出浓度：0.5%~5%可调 麻醉气体过滤方式：活性炭（可选配负压气体回收系统） 呼吸频率调节范围：1 – 200次/分 潮气量调节范围：0.1-10ml. 吸呼比调节：1:5~5:1 气道压力超过6Kpa时自动泄压保护 冷光源数量：2个，独立开关无级可调 肛温显示精度：0.1° 肛温探头规格：直径1.5mm圆头 加热垫尺寸:250mm长150mm 恒温手术台尺寸：300X200X40mm 文献引用： |
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