Research Article，2024-05-09，Microbiome，[IF 15.5]
原文链接：https://link./article/10.1186/s40168-024-01791-3
第一作者：Ming Yan （严鸣)
通讯作者：Zhongtang Yu （于忠堂）
通讯单位：美国俄亥俄州立大学动物科学学院 （Department of Animal Sciences, The Ohio State University, Columbus, OH, USA)
美国俄亥俄州立大学微生物组研究中心 （Center of Microbiome Science, The Ohio State University, Columbus, OH, USA)
基于本团队于2023年8月29日，发表在Nature communications的研究（https://www./articles/s41467-023-41075-2），美国俄亥俄州立大学动物科学学院以及微生物组研究中心的Zhongtang Yu教授团队于近日在Microbiome发表了其后续的研究成果，题为Viruses contribute to microbial diversification in the rumen ecosystem and are associated with certain animal production traits (https://link./article/10.1186/s40168-024-01791-3)
瘤胃微生物组中的细菌和其他微生物共同将反刍动物难以直接利用的植物高纤维成分转换成能量，并且产生高品质的微生物蛋白，供动物合成自身蛋白质。然而，这个转换过程效率低下，同时伴随着大量温室气体的排放。针对瘤胃微生物组的众多研究致力于通过调节瘤胃中的微生物发酵过程，以提高生产效率并减少温室气体排放。然而，噬菌体作为微生物生态中的关键调控元素，它如何调整瘤胃微生物群落的结构，从而进一步影响瘤胃发酵以及反刍动物的生产表现以及甲烷排放，这一问题依旧没有得到充分的阐释。
利用本课题组最新建立的瘤胃病毒组数据库（RVD），本研究进一步在种与株水平上，通过同时分析551个瘤胃宏基因组的病毒与细菌组成，阐明了微生物和病毒在共同进化、共存模式以及群体分布之间的相互作用。此外，本研究通过分析在细菌基因组中的原噬菌体（prophage），评估了瘤胃噬菌体在微生物多样化中的潜在作用。通过病毒-微生物共存网络以及侵染网络分析，本研究表明，瘤胃中的噬菌体可以通过对立（antagonistic）和互利（mutualistic）的相互作用，在菌株和群落水平上调控微生物。此外，本研究确定，瘤胃病毒组组成，与关键的动物生产性状相关联，包括饲料转化效率和甲烷排放效率。这些发现为进一步探索瘤胃中病毒组在调节微生物组分化与组成，和影响整体动物生产性能中的作用提供了实质性的框架。
瘤胃微生物组通过消化动物宿主无法消化的纤维性饲料，以及将低营养价值的饲料蛋白转化为高营养价值的微生物蛋白，在反刍动物营养利用上发挥着至关重要的作用。然而，其所涉及的微生物转化效率不高，且在此过程中导致大量甲烷和的废氮排放。大量研究试图阐明瘤胃微生物组内部的相互作用，尤其是关注其与动物管理、动物遗传学和动物表型的关联。值得注意的是，除了极少数外研究外，所有这些研究都只强调了细菌、古菌、原生动物和真菌的作用，而大大忽视了瘤胃病毒。因此，尽管瘤胃噬菌体是瘤胃生态系统中不可忽视的组成部分，且在瘤胃微生物生态系统中起到了生态位调控者的作用，人们对瘤胃噬菌体在促进瘤胃微生物进化与组成，以及其对与宿主表现型的作用仍了解不足。
微生物病毒在不同生态系统中皆具有重大影响。在海洋环境中，病毒每天裂解约20%的微生物，造成100亿吨的日均碳排放，并通过“病毒分流”（viral shunt）极大地影响生物地球化学循环。人类肠道病毒组相对稳定，但在个体的一生中显示出相当大的多样性，并与慢性疾病相关联。瘤胃病毒同样具有高度的多样性，并能侵染包括产甲烷菌在内的多样化的瘤胃微生物。通过在不同营养层次（trophic levels）上裂解瘤胃微生物，瘤胃病毒可能调节其微生物宿主的种群组成，从而调节营养物质和微生物蛋白的循环。因此，揭示瘤胃生态系统内病毒-微生物相互作用的复杂性，对于高效、长效的调控瘤胃发酵以及动物生产效率，包括饲料利用效率、泌乳性能和甲烷排放等方面具有重要作用。
病毒通过几种假设的病毒-微生物相互作用模式，如“kill the winner”、“piggyback the winner”和“arms-races”，影响着微生物的多样性、种群动态和代谢活动。具体而言，通过选择性地裂解优势微生物，病毒有助于维持群体多样性。它们还通过促进水平基因转移以及适应性共同进化（adaptive co-evolution），促进宿主适应性和多样化。除此之外，无论是隐性（cryptic）的还是非隐性(non-cryptic)的原噬菌体，都作为辅助基因库，携带提高宿主生存能力的基因。最后，病毒可以通过提供辅助代谢基因（AMGs）直接影响宿主的代谢，从而影响环境和胃肠生态系统（包括人类肠道和瘤胃）中的关键生态过程。
先前的研究记录了反刍动物瘤胃病毒组对饮食变化的响应，并提出了它们对关键瘤胃细菌的潜在影响。然而，对于瘤胃病毒组的多样性、与宿主的互动以及其在调控瘤胃功能和动物生产性能方面的作用，目前的了解仍然很有限。为了弥补这一知识空白，我们最近利用最新的生物信息学流程，针对近1000个瘤胃宏基因组的宏基因组病毒组分析，开发了一个全面的瘤胃病毒组数据库（RVD）。我们揭示了感染瘤胃内各种细菌、古生菌和原生动物类群的病毒的巨大多样性，以及一系列多样的辅助代谢基因（AMGs），包括那些编码关键酶如纤维素酶的基因。这些病毒的发现以及它们与宿主的联系，暗示了它们对瘤胃生态系统的重大影响。在这些发现的基础上，我们假设瘤胃病毒组与微生物组在多个范畴内密切互动，并与包括甲烷排放在内的重要动物生产性状相关联。为了验证这一假设，我们系统地在菌株水平上对噬菌体进行了表征与进化学分析，以解密病毒宿主在种内及种间（inter- and intra-species）特异性。此外，我们构建并比较了微生物-病毒共存以及感染网络，以确定瘤胃病毒在塑造瘤胃微生物组结构中的作用。最后，我们分析了10项独立研究中的瘤胃宏基因组，揭示了瘤胃病毒组、微生物组与关键动物生产性状之间的关联，包括饲料效率和甲烷排放效率。总体而言，这些结果表明瘤胃病毒组在调节微生物生态结构、进化、多样化和功能方面发挥着关键作用，并且与重要的动物生产性状密切相关。
前期方法优化
为更好的研究物种水平上的噬菌体-细菌互作，本文作者首先基于GTDB数据库，以及几千个多样的瘤胃原核生物基因组（MAGs）客制了基于GTDB物种分类的kraken2 分类工具（Rumen Kraken2 Classifier）。Rumen Kraken2 Classifier相较于基于标准数据库（kraken2 standard database）,识别率（classification rate）从20%提升至接近75%， 加入的瘤胃原核生物基因组在此基础上进一步提升了3%的识别率（Supplementary Fig. 1a）。除此之外，Rumen Kraken2 Classifier因为基于GTDB分类法，使得绝大大部分序列都能在物种水平上被分类。因此，通过使用Rumen Kraken2 Classifier和RVD，我们得以在物种水平上分析噬菌体-细菌的相互作用。
Supplementary Fig. 1a：Rumen Kraken2 Classifier大幅提升物种水平识别率。
基于此工具，作者在物种水平上重新识别了一系列核心瘤胃原核生物（存在于全部975个瘤胃宏基因组样品; Supplementary Fig. 2），以区别于此前基于16s序列和NCBI 分类法的结果，且使我们得以在物种水平上了解瘤胃病毒对关键瘤胃原核生物的影响。结果显示了Prevotella在瘤胃微生物群落中占绝对的主导地位。出乎意料的是，尽管产甲烷菌普遍存在于瘤胃生态系统中，没有任何单一产甲烷菌物种存在于所有样品中。
Supplementary Fig. 2: 基于GTDB分类法的核心瘤胃微生物及其分布。
我们紧接着通过100次随机迭代（见原文方法），测试了核心瘤胃微生物是否存在冗余（某些核心物种是否可能不存在于新增的样品中；Supplementary Fig. 1b）。结果显示，核心瘤胃物种在物种水平上达到平滞（plateau），证明了所得到核心瘤胃微生物物种的可靠性。
Supplementary Fig. 1b: 核心瘤胃微生物物种数量在100次随机迭代中显示为收敛。
原噬菌体分析
通过分析瘤胃原核生物基因组的原噬菌体序列, 我们发现大多数瘤胃原核生物基因组都包含至少一个的原噬菌体序列（Fig. 1a）, 且大多数识别到的原噬菌体未能被归为已知的噬菌体family （Fig. 1b）。功能上，研究发现了携带抗生素抗性基因的原噬菌体（Fig. 1c）。进化学上，通过在株水平上分析RUG2的240个宏基因组数据，我们发现大多数瘤胃宏基因组样品至少有一个物种存在由原噬菌体导致的菌株水平的异质性（Fig. 1d），且携带的原噬菌体基因可能直接导致细菌菌株水平的分化。具体而言，我们发现一个携带原噬菌体的菌株与其他同一物种的不同菌株同时存在于37个不同的样品，且其中的一个功能未知的原噬菌体基因在大多数样品中的被正向选择（pN/pS > 1）。
Fig. 1：从反刍动物瘤胃微生物基因组中鉴定出的原噬菌体。
株水平的感染特异性
通过在菌株水平上分析噬菌体的感染规律，我们发现噬菌体通过菌株水平上的宿主特异性，以调控其宿主的多样性（Fig. 2）。具体而言，尽管多数噬菌体只能侵染单一菌株，我们仍发现了能同时侵染不同菌株的噬菌体，其中部分噬菌体能侵染不同物种的多个菌株。与此同时，我们发现部分菌株能够免疫噬菌体感染。总的来说，在微生物防御与病毒反防御之间的动态平衡可能导致由于genetic sweeps而引起的丰度波动。同时，复杂的嵌套感染（噬菌体感染多种菌株/物种和微生物被多种噬菌体感染）突显了病毒与微生物之间错综复杂的相互作用。
Fig. 2: 反刍动物瘤胃病毒的菌株水平宿主特异性。
共生网络揭示瘤胃病毒生态位调控重要性
我们还构建了一个病毒-微生物共生网络（phage-microbe network）来并与微生物共生网络（microbe-only network）相比较以研究病毒与微生物之间的相互作用（Fig. 3）。Phage-microbe network包括570个病毒节点和671个也存在于microbe-only network的微生物节点。在phage-microbe network中，有22个微生物节点没有与其他微生物节点连接。仅考虑微生物节点时，平均度中心性（centrality）为5.23（±3.94），显著高于microbe-only network（p < 0.001）。虽然模块化指数（modularity index）为0.60，相比于microbe-only network略低，但Phage-microbe network仍展现出高度的的群体连接。微生物-病毒交互可能标志着共存策略，不论是作为宿主微生物内的原噬菌体还是与抗病毒微生物（virus-resistant）共存的裂解性病毒。在后一种情况下，这可能是因为抗病毒微生物受益于由于竞争减少以及被裂解性病毒裂解的微生物释放的营养物质增加。因此尽管病毒在细胞层面可能表现为对抗性，但病毒-微生物网络中微生物节点的连接性增加和同质性的减少（augmented connectivity and reduced assortativity），表明病毒可能促进微生物间的相互作用，并允许多样的微生物占据相同的生态位。这一推论进一步得到了Fig. 2a所示的模块化和嵌套的病毒-微生物感染网络的支持。总的来说，这些复杂的病毒-微生物相互作用超出了捕食-被捕食关系，并表明瘤胃病毒和微生物在微生物群落水平上可能是互惠互利的，这支持了先前在人类肠道生态系统中的发现。噬菌体之间的相互作用可能则源于由噬菌体引起的超感染免疫（superinfection immunity）或同一细菌物种的共同感染。
Fig. 3: 共生网络展示了瘤胃微生物组的模块化组织和微生物-病毒的相互作用。
瘤胃病毒作为基石物种（keystone species）调控瘤胃菌群结构
我们同时发现了具有高degree centrality和betweenness centrality的瘤胃病毒，说明瘤胃病毒在维持微生物生态结构性的重要作用（Supplementary Fig. 6）。
Supplementary Fig. 6: 作为基石物种的瘤胃病毒与瘤胃细菌
瘤胃病毒与动物生产性状关联
反刍动物瘤胃微生物组、饮食摄入、动物生产表现以及甲烷排放之间的复杂联系是反刍动物瘤胃微生物组研究中的一个关键点。然而，很少有研究探讨了瘤胃噬菌体与上述因素或特定生产特性的交互作用。迄今为止，只有一项研究展示了饮食能量水平对瘤胃噬菌体和微生物组的影响。在当前研究中，我们分析了来自9个独立研究（包括不同的处理组）的311个瘤胃宏基因组以及RUG2 数据组的240个样品的噬菌体以及微生物组成，以探究瘤胃噬菌体、其微生物宿主、动物营养调控和动物生产特性之间的关联。结果显示，日粮组成与动物生产效率都可影响噬菌体的丰富度，但影响程度不一（Fig. 4a）。肉牛的平均日增重和绵羊的甲烷排放量与瘤胃病毒的丰富度呈正相关，但肉牛和乳牛的饲料效率、牛奶蛋白质产量和饱和脂肪酸产量与噬菌体丰富度之间没有显示出任何关联（Fig. 4b）。瘤胃噬菌体与某些动物生产性能指标之间缺乏显著关联可能归因于动物本身的因素。在分析同一瘤胃宏基因组中微生物丰富度与病毒丰富度之间的相关性时，只有在一些处理组中观察到微生物组和噬菌体丰富度之间的显著相关性，而且没有一致的方向性，这表明其他因素可能影响它们的相互作用和种群动态。鉴于瘤胃噬菌体的高度个体化特性，瘤胃病毒和微生物之间的相互作用，尤其是那些低丰度的微生物，可能受到决定性因素例如饮食和动物遗传，以及其他随机性因素影响。
Fig. 4: 瘤胃病毒的丰富度与日粮组成以及动物生产特性相关联。
我们进一步分析了不同动物群体间瘤胃噬菌体的β多样性，结果显示瘤胃噬菌体组成在不同饮食（Fig. 5a）以及生产性能（Fig. 5b）之间存在差异。尽管一些研究报告了瘤胃微生物组成与上述处理之间的相关性，但结果存在不一致性。
Fig. 5: 不同饮食组成和不同动物生产特性之间的瘤胃噬菌体组成差异
除了改变微生物组结构外，瘤胃中的病毒还可能通过影响关键微生物物种的丰度直接调节其中的发酵过程。通过差异丰度分析，我们鉴定了几十个在不同饮食组成（Fig. 6a）和动物生产指标（Fig. 6b）中丰度不同的vOTUs（q < 0.1）。由于相当比例的vOTUs无法在vOTUs以上的任何分类级别进行分类，因此仅在vOTUs水平上分析了丰度差异。一些丰度差异显著的vOTUs的宿主也显示出了在不同处理组中差异性的丰度（q < 0.1；在Fig. 6中以红色箭头标示）。由于上述差异性显著的vOTUs为溶原性噬菌体，它们的分布趋势可能象征着不同的生命周期。
Fig. 6: 在饲喂不同饲粮或具有不同效率的反刍动物中，噬菌体及其感染的细菌丰度差异性分布。
最后，通过比较瘤胃宏基因组中病毒-宿主的VHR（病毒宿主比率），我们评估了饮食或动物生产性能与溶原噬菌体生命周期变化之间的潜在关联。我们发现，不同日粮组成的溶原噬菌体的VHR显著差异（Supplementary Fig. 8a）。这种差异很可能是由于增加的饲料发酵和短链脂肪酸（SCFAs）的产生所致，而这些已知能够诱导溶原噬菌体。实际上，某些食物和食物提取物已被显示能够在人类微生物组中诱导溶原噬菌体。例如果糖和SCFAs可诱导肠道微生物中的溶原噬菌体生命周期的转变。此外，亚急性瘤胃酸中毒，通常由高浓缩饲料饮食的动物快速产生SCFA引起，也显示能够显著增加瘤胃病毒的丰度。与此同时，在具有不同甲烷效率的动物群体中，病毒宿主比率也存在显著差异（Supplementary Fig. 8b）。因此，虽然瘤胃噬菌体组的变化在很大程度上反映了微生物组结构的改变，但瘤胃环境的变化可能调节病毒生命周期动态，这反过来又可以影响瘤胃微生物组结构以及微生物发酵。
Supplementary Fig. 8: 病毒宿主比率在不同处理组中存在显著差异。
由病毒裂解引起的瘤胃微生物的周转（turnover）可能对某些瘤胃功能，特别是发酵和微生物蛋白质合成产生深远影响。尽管经估计海洋噬菌体每天裂解约20%的海洋细菌，但归因于病毒的瘤胃微生物裂解率仍然未定。考虑到瘤胃中病毒和微生物的高丰度，瘤胃内的病毒裂解可能相当可观。因此，我们提出了两个关键问题：病毒介导的特定瘤胃微生物（特别是那些与动物生产性能和甲烷排放相关的微生物）和总体瘤胃微生物周转率是多少？溶源性和裂解性循环在瘤胃生态系统中各占据何种比例，是否能通过调控日粮组成加以影响？早期的研究使用透射电子显微镜计数噬菌体，或使用瘤胃内总噬菌体DNA浓度对噬菌体群体大小进行了估计。然而，高噬菌体计数并不一定与高微生物宿主死亡率相关。例如，即使在高free phage particles浓度的情况下，仅有不到1%的cyanobacteria细胞被感染。值得注意的是，上述两种方法可能低估了噬菌体的丰度，因为它们主要计算自由裂解噬菌体(free lytic virions)。相比之下，通过宏基因组序列计算得到的病毒宿主比例（VHR）不仅可以量化free virions和temperate phages，还可以量化intracellular lytic phages。此外，单细胞聚集体(single-cell polony)方法可以同时识别数千个不同微生物细胞的病毒感染情况。利用这些方法，未来研究应关注量化病毒与宿主组成、宿主死亡率及其与瘤胃生态系统中净微生物蛋白质合成的关联。
总之，本研究深入探讨了瘤胃生态系统内病毒的角色，这一领域至今仍然大体上未知。通过对瘤胃宏基因组的全面分析，我们初步揭示了的病毒-微生物之间的复杂关系，为微生物生态系统组成之间的多样性、共生现象和相互作用提供了新的见解。此外，本研究表明，瘤胃病毒可能通过对立和互利的相互作用，在菌株和群落层面对瘤胃微生物施加调节作用。值得注意的是，瘤胃病毒组表现出对饲喂条件以及重要的动物生产性状（如饲料效率和甲烷排放效率）相关联。这些发现为未来的研究工作奠定了坚实的基础，包括解读瘤胃病毒组在塑造瘤胃微生物组及其对整体动物生产性能的影响。未来的研究还应该调查瘤胃中的单链DNA或RNA病毒，因为它们在RVD和瘤胃宏基因组中代表性不足。
Yan, M., Yu, Z. Viruses contribute to microbial diversification in the rumen ecosystem and are associated with certain animal production traits. Microbiome 12, 82 (2024). https:///10.1186/s40168-024-01791-3
严鸣，俄亥俄州立大学博士生，即将入职加州大学伯克利分校创新基因组研究所，主要从事宏基因组学与生物信息学的研究。近两年以第一作者在Nature communications, Microbiome, Critical Reviews in Food Science and Nutrition等期刊上发表论文5篇，以共同第一作者在Science of the total environment发表论文一篇。
于忠堂，美国俄亥俄州立大学教授、博士生导师。Microbiome、Journal of Dairy Science等杂志编辑。研究方向包括家畜肠道微生物与环境微生物生态学研究和生物质废弃物转化的微生物学基础研究等。在The ISME Journal、PNAS、Nature communications、和Microbiome等刊物发表文章200余篇，所发文章被引用超过21000次。
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