祁连山国家级自然保护区大型真菌资源

东营菌物科学 2024-05-14 发布于山东

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卢伯宇，魏书威，李姝，宋利茹，王琦

1. 食药用菌教育部工程研究中心，长春130118；2. 吉林农业大学菌物学院，长春 130118；3. 河西学院甘肃省应用真菌工程实验室，张掖734000

摘要通过对祁连山国家级自然保护区大型真菌进行采集，共获得3 034份标本，鉴定出214种，隶属于4纲13目36科80属，其中食用菌63种、药用菌40种、毒菌27种，对种级分类水平的大型真菌进行α多样性分析，发现祁连山国家级自然保护区物种丰富度较高，物种均匀度高。在野外调查的基础上，研究团队构建了祁连山国家级自然保护区菌物资源“一馆五库”保育体系，其中，标本馆保存3 034份标本，菌种库保存30种大型经济真菌的79株菌种，活体库保存1 573份干燥菌体组织，基因库保存357份DNA样品及其ITS序列信息，化合物库保存3种大型真菌的脂溶性成分信息及其色谱图，综合信息库保存3 034份标本的编号、采集日期、采集人、照片、活体、菌株、中文名、拉丁学名、地理信息（经度、纬度、海拔）、采集地名等综合信息。

关键词祁连山；α多样性；经济真菌；一馆五库

大型真菌一般是指菌物中子实体大型的一类真菌，特点是“肉眼可见，伸手可采”，它们是生态环境中不可缺少的一部分。Hawksworth估计全球真菌总种数为150万种，2008年全世界报道近10万种，2018年中国记录真菌种数约为2.79万种。为维护生态环境的稳定，欧洲菌物学家在1985年就成立了欧洲真菌保护委员会。由李玉院士提出的“一区一馆五库”保护体系也是对大型真菌资源及真菌多样性的有效保护措施，该措施涵盖了菌物保育区、标本馆、菌种库、活体库、基因库、化合物库及综合信息库，从物种、遗传及功能等多方面保护菌物资源。保护大型真菌资源的前提是探清大型真菌资源状况，从而合理开发与利用。

甘肃省域内的祁连山自然保护区（以下简称保护区）于1987年10月24日成立，次年5月9日成为国家级森林和野生动物类型自然保护区。地理位置位于东经97°23′34″~103°45′49″，北纬 36°29′57″~39°43′39″，保护区总面积约19 872 km²，其中，核心区面积5 041 km²，缓冲区面积3 874 km²，实验区面积10 957 km²。年平均气温约0.7 ℃，年降雨量300~500 mm，海拔2 000~4 000 m。祁连山保护区大型真菌资源丰富，桂建华报道该保护区大型真菌141种，席亚丽等报道大型真菌146种。目前，违法违规开发矿产资源、违法建设并运行水电设施、周边企业偷排偷放等问题已经对保护区的生态环境造成了严重的破坏。为了对保护区内的大型真菌进行保护，本研究对区内的大型真菌进行了调查，归类出具有经济价值的食用菌、药用菌和有毒真菌，并初步构建出保护区内大型真菌的菌物标本馆、菌种库、活体库、基因库、化合物库和综合信息库的五库系统，为合理开发、利用这些大型经济真菌资源提供参考和资料。

1 材料与方法

1.1 大型真菌标本采集

2018年6‒10月及2019年6‒9月采用随机踏查法在保护区内采集标本。按照地理方位的不同，将20个采集点划分为4个统计样地，分别为A区（东部）：古城站、哈溪站、华隆站、上房寺站、十八里堡站、乌鞘岭站、夏玛站；B区（中部）：祁连站、东大河站、军马场站、西营河站；C区（西部）：大河口站、康乐站、隆畅河站、寺大隆站、马蹄寺站、西水站；D区（北部）：大黄山站、东大山站、龙首山站。

1.2 大型真菌形态学鉴定

采用传统形态学方法进行鉴定，宏观形态主要通过野外拍摄照片并记录详细信息，主要包括大型真菌的菌盖、菌褶、菌柄的宏观形态，如颜色、大小、有无鳞片等；是否存在菌环，菌环的位置；是否存在菌托，菌托的大小等。微观上利用显微镜观察孢子的形态特征（形状、颜色、有无刺疣等）、担子、囊状体形态，菌盖皮层结构、菌髓、有无锁状联合等特征，以5%KOH溶液为浮载剂，梅氏试剂检测大型真菌中孢子及囊状体等结构是否含有淀粉质。

部分存疑种采用分子生物学方法进行辅助验证。采用天根植物提取试剂盒进行大型真菌DNA的提取，采用大型真菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）扩增ITS序列（引物由北京六合华大科技有限公司合成提供），将自测序列输入分子数据库GenBank进行BLAST比对，并进行同源序列的检索，确定大型真菌标本的种类。

根据鉴定结果查阅相关书籍和文献，对大型真菌的食用性、药用性和毒性3个方面进行整理归纳，评价出具有经济价值的大型真菌，以期合理开发利用大型经济真菌资源。

1.3 大型真菌多样性分析方法

划分好样地后，分别从物种丰富度和物种均匀度2个方面进行计算。由于样地划分是依据地理方位的不同，并且采取的是随机踏查的方法进行采集，故选用定量的标本数中物种数目，即数量丰度来表示物种丰富度；使用Simpson指数和Shannon-Wiener指数计算多样性指数，分析物种均匀度，所用到的公式如下所示：物种丰富度：Pi=Ni/N（Ni为单一地区的物种数量，N为总物种数量）；d=S/N，其中S为物种数目，N为标本数量；Simpson指数：D=1-∑Pi²；Shannon-Wiener指数：H=-∑（Pi）（lnPi）。

1.4 “一馆五库”的构建方法

为实现大型真菌的合理开发及保育，以西藏大型真菌“一馆五库”的建设为基础，初步构建祁连山国家级自然保护区大型真菌的菌物标本馆、菌种库、活体库、基因库、化合物库和综合信息库。标本馆：对保护区采集到的所有菌物标本进行整理、鉴定、保存；菌种库：对采集到的新鲜菌物标本进行菌种分离、鉴定、继代、保藏；活体库：对采集的新鲜菌物标本组织进行快速干燥处理，保藏重要种群干燥活体组织；基因库：保存菌物基因组DNA、ITS等基因片段信息；化合物库：保存重要食药用菌物主要化学成分、活性成分及其谱图信息；综合信息库：保存菌物标本综合信息，包括拉丁学名、分类地位、采集信息、照片、活体、菌株、地理信息（经度、纬度、海拔）等。

2 结果与分析

2.1 祁连山国家级自然保护区大型真菌多样性分析

通过鉴定，依据参考文献［13~20］共获得大型真菌214种，隶属于2门4纲13目36科80属，包括担子菌门10目29科70属197种，子囊菌门3目7科10属17种，其中有71种为甘肃省新记录种。优势科（含10种及10种以上的科）有6个，分别是蘑菇科Agaricaceae、口蘑科Tricholomataceae、丝膜菌科Cortinariaceae、红菇科Russulaceae、丝盖伞科Inocybaceae、球盖菇科Strophariaceae（图1）。

图1 优势科及其含有种数Fig. 1 Dominant families with their species

1. 蘑菇科Agaricaceae; 2.口蘑科Tricholomataceae; 3. 丝膜菌科Cortinariaceae; 4. 红菇科Russulaceae; 5. 丝盖伞科Inocybaceae; 6. 球盖菇科Strophariaceae

优势属（含5种及5种以上的属）有12个，分别是蘑菇属Agaricus、丝膜菌属Cortinarius、马勃属Lycoperdon、丝盖伞属Inocybe、杯伞属Clitocybe、乳菇属Lactarius、地星属Geastrum、红菇属Russula、环柄菇属Lepiota、铦囊蘑属Melanoleuca、裸脚菇属Gymnopus及鬼伞属Coprinus（图2）。

图2 优势属及其含有种数Fig. 2 Dominant genera with their species

1. 蘑菇属Agaricus; 2. 丝膜菌属Cortinarius; 3. 马勃属Lycoperdon; 4. 丝盖伞属Inocybe; 5. 杯伞属Clitocybe; 6. 乳菇属Lactarius;7. 地星属Geastrum;8. 红菇属Russula;9. 环柄菇属Lepiota;10.铦囊蘑属Melanoleuca;11. 裸脚菇属Gymnopus;12. 鬼伞属Coprinus

2.2 α多样性分析

2.2.1 物种丰富度

将4个样地的标本数量和物种数量代入公式，算出各自的d值，依照d值的大小即可判断该地区的物种丰富度。由表1可知，假设4个样地面积相同时，物种丰富度由高到低依次是A区、C区、B区及D区。其中A区和C区物种丰富度较接近。D区数值最高，表明该地区物种丰富度最低，分析原因可能是由于D区靠近北方，降水、温度等条件不太适合大型真菌生长，也可能与该地所采集得到的标本数量少与鉴定情况等因素有关。

表1 不同样地的物种丰富度Table 1 Species richness within different collecting plots

2.2.2 物种均匀度

单凭物种丰富度不足以判断一个地区的多样性水平，还需要另一个重要指标即物种均匀度来检测。以部分对整体的比例为基础计算多样性指数，采用物种数进行计算，得到对应的Simpson和Shannon-Wiener指数，由表2可知，4个样地的Simpson指数均较高，表明各个样地的物种均匀度指数高，显示各个样地中大型真菌每个物种几乎没有优势度。A区、B区和C区Shannon-Wiener指数较为接近，而D区数值明显低于其他3个区域，与D区的物种丰富度相互验证，表明D区可能不适合大型真菌的生长。

表2 不同样地的物种均匀度Table 2 Species evenness within different collecting plots

2.3 大型经济真菌资源

2.3.1 食用菌资源

祁连山国家级自然保护区内可食用的大型真菌共63种，占总数的29.44%，分别是田野蘑菇Agaricus arvensis、橙黄蘑菇A. augustus、双孢蘑菇A. bisporus、蘑菇A. campestris、小白蘑菇A. comtulus、浅灰白蘑菇A. devoniensis、白杵蘑菇A. nivescens、絮缘蘑菇A. subfloccosus、硬田头菇Agrocybe dura、平田头菇A. pediades、蜜环菌Armillaria mellea、芥黄蜜环菌A. sinapina、香杏丽蘑Calocybe gambosa、白秃马勃Calvatia candida、冠锁瑚菌Clavulina cristata、皱锁瑚菌C. rugosa、污白杯伞Clitocybe houghtonii、香杯蕈C. odora、墨汁鬼伞Coprinus atramentarius、毛头鬼伞C. comatus、牛丝膜菌Cortinarius bovinus、紫红丝膜菌C. rufo-olivaceus、黄绿卷毛菇Floccularia luteovirens、绒柄裸脚菇Gymnopus confluens、栎裸脚伞G. dryophilus、早生裸脚伞G. ocior、美味蜡伞Hygrophorus agathosmus、斑玉蕈Hypsizygus marmoreus、松乳菇Lactarius deliciosus、红汁乳菇L. hatsudake、微甜乳菇L. subdulcis、苍白乳菇L. pallidus、毛头乳菇L. torminosus、虎纹香菇Lentinus tigrinus、紫丁香蘑Lepista nuda、粉紫香蘑L. personata、花脸香蘑L. sordida、球跟白丝膜菌Leucocortinarius bulbiger、褐皮灰包Lycoperdon fuscum、网纹灰包L. perlatum、多形灰包L. polymorphum、梨形马勃L. pyriforme、银白离褶伞Lyophyllum connatum、荷叶离褶伞L. decastes、真姬离褶伞L. shimeji、脐顶小皮伞Marasmius chordalis、硬柄小皮伞M. oreades、钟形铦囊蘑Melanoleuca exscissa、烟色垂幕菇Hypholoma capnoides、泡状鳞伞Pholiota spumosa、翘鳞环锈伞P. squarrosa、宽鳞多孔菌Polyporus squamosus、灰假杯伞Pseudoclitocybe cyathiformis、冷杉枝瑚菌Ramaria abietina、深褐枝瑚菌R. fuscobrunnea、非白红菇Russula exalbicans、淡味红菇R .nauseosa、大红菇R. rubra、银耳Tremella fuciformis、金黄银耳T. mesenterica、银盖口蘑Tricholoma argyraceu、棕灰口蘑T. terreum、黄拟丝盖伞Pseudosperma rimosum。

以上食用菌主要集中于蘑菇科Agaricaceae、口蘑科Tricholomataceae和红菇科Russulaceae，比较重要的一些食用菌如下：黄绿卷毛菇F. luteovirens、荷叶离褶伞L. decastes、变绿枝瑚菌Ramaria abietina、斑玉蕈H. marmoreus、毛头鬼伞C. comatus、虎纹香菇L. tigrinus、银耳T. fuciformis、平田头菇A. pediades、白杵蘑菇A. nivescens、双孢蘑菇A. bisporus、松乳菇L. deliciosus等。

2.3.2 药用菌资源

药用菌一般指具有药用价值的大型真菌，在祁连山国家级自然保护区内所采集到的标本中，药用菌共40种，占总物种数的18.69%，分别是田野蘑菇A. arvensis、双孢蘑菇A. bisporus、蘑菇A. campestris、硬田头菇A. dura、平田头菇A. pediades、芥黄蜜环菌A. sinapina、亚黑管孔菌Bjerkandera fumosa、白秃马勃C. candida、晶粒小鬼伞Coprinellus micaceus、褶纹鬼伞C. plicatilis、粪生鬼伞C. sterquilinus、牛丝膜菌Cortinarius bovinus、紫红丝膜菌C. rufo-olivaceus、毛嘴地星Geastrum fimbriatum、袋形地星G. saccatum、尖顶地星G. triplex、粉红地星G. rufescens、栎裸脚伞G. dryophilus、冷杉附毛孔菌Trichaptum abietinum、斑玉蕈H. marmoreus、黄汁乳菇Lactarius chrysorrheus、松乳菇L. deliciosus、红汁乳菇L. hatsudake、苍白乳菇L. pallidus、紫丁香蘑L. nuda、粉紫香蘑L. personata、花脸香蘑L. sordida、褐皮灰包L. fuscum、莫尔马勃L. molle、网纹灰包L. perlatum、多形灰包L. polymorphum、梨形马勃L. pyriforme、荷叶离褶伞L. decastes、硬柄小皮伞M. oreades、黄褐环绣伞Pholiota spumosa、灰假杯伞Pseudoclitocybe cyathiformis、绯红肉杯菌Sarcoscypha coccinea、云芝Trametes versicolor、银耳T. fuciformis、冷杉附毛孔菌T. abietinum，其中26种为食药兼用菌，分别是田野蘑菇A. arvensis、双孢蘑菇A. bisporus、蘑菇A. campestris、硬田头菇A. dura、平田头菇A. pediades、芥黄蜜环菌A. sinapina、白秃马勃C. candida、牛丝膜菌C. bovinus、紫红丝膜菌C. rufo-olivaceus、栎裸脚伞G. dryophilus、斑玉蕈H. marmoreus、松乳菇L. deliciosus、红汁乳菇L. hatsudake、苍白乳菇L. pallidus、紫丁香蘑L. nuda、粉紫香蘑L. personata、花脸香蘑L. sordida、褐皮灰包L. fuscum、网纹灰包L. perlatum、多形灰包L. polymorphum、梨形马勃L. pyriforme、荷叶离褶伞L. decastes、硬柄小皮伞M. oreades、黄褐环绣伞P. spumosa、灰假杯伞P. cyathiformis、银耳T. fuciformis（图3）。

图 3 部分食药用菌子实体Fig. 3 Fruiting bodies of edible and medicinal fungi

A1~A3. 斑玉蕈Hypsizygus marmoreus；B1~B3. 荷叶离褶伞Lyophyllum decastes；C1~C3. 黄绿卷毛菇Floccularia luteovirens；D1~D3. 松乳菇Lactarius deliciosus；E1~E3. 红汁乳菇Lactarius hatsudake；F1~F3. 紫丁香蘑Lepista nuda；G1~G3. 双孢蘑菇Agaricus bisporus；H1~H3. 蜜环菌Armillaria mellea；I1~I3.棕灰口蘑Tricholoma terreum；JI~J2.香杏丽蘑Calocybe gambosa；K1.银耳Tremella fuciformis。图中以标签为标尺，标签长3 cm（白色部分2 cm，黑色部分1 cm） A piece of 3 cm-length label within each photo serves as the size ruler (white color, 2 cm length; black color, 1 cm length)

2.3.3 有毒真菌资源

在祁连山国家级自然保护区内采集到的标本中，有27种有毒真菌，占总物种数的12.62%，分别是毒杯伞Clitocybe cerussata、白霜杯伞C. dealbata、白杯伞C. phyllophila、乳白锥盖伞Conocybe apala、晶粒小鬼伞C. micaceus、栗色丝膜菌Cortinarius castaneus、芥味滑锈伞Hebeloma sinapizans、皱马鞍菌Helvella crispa、马鞍菌H. elastica、变红丝盖伞Inocybe erubescens、光帽丝盖伞I. nitidiuscula、裂丝盖伞I. rimosa、毛头乳菇L. torminosus、锐鳞环柄菇Lepiota acutesquamosa、栗色环柄菇L. castanea、冠状环柄菇L. cristata、血红小菇Mycena haematopus、洁小菇M. pura、钟形花褶伞Panaeolus campanulatus、紧缩斑褶菇P. sphinctrinus、波缘盘菌Peziza repanda、林地盘菌P. sylvestris、黄盖小脆柄菇Psathyrella candolleana、小孢白枝瑚菌Ramaria flaccida、毒红菇Russula emetica、凯莱红菇R. queletii、绯红肉杯菌Sarcoscypha coccinea。

2.4 “一馆五库”保护体系

在野外调查工作的基础上，于吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心构建了祁连山国家级自然保护区的“一馆五库”保护体系，包括菌物标本、菌种及活体组织保存，及其基因信息、化合物信息和综合信息的储存，收集、保护菌类作物种质资源菌物物种多样性、遗传多样性和生态多样性。

标本馆：配有标本盒、标本柜、干燥器、低温冰箱（-80 ℃）、空调、二氧化碳灭火器等材料与设备，标本附干燥剂装入自封袋，置于标本盒中，依据采集编号顺序保存于标本柜，定期检查标本状态。标本馆共储存祁连山国家级保护区的大型真菌干标本3 034份，目前已鉴定出千余份，隶属于4纲13目36科80属214种，其中食用菌66种、药用菌43种、有毒真菌27种。

菌种库：设有4 ℃低温库、液氮保藏库。目前保藏了30种大型经济真菌菌种，共计79株，包括斑玉蕈、黄绿卷毛菇、荷叶离褶伞等珍稀食药用菌菌株，可作为野生种质资源储备。

活体库：保存干燥的活体组织1 573份，其中包括大型经济真菌的干燥活体组织216份，有效地保存了紫红丝膜菌、钟形铦囊蘑、蜜环菌等重要菌物种群的遗传信息，存放于-80 ℃冰箱，为后续研究提供基础材料。

基因库：保存357份DNA样品和357条ITS序列，其中大型经济真菌的ITS序列50条，共20个种，包含了平田头菇、松乳菇、香杯蕈在内的珍稀菌物遗传物质库和相应的序列标签信息库。

化合物库：收录银白离褶伞、紫红丝膜菌、双孢蘑菇3种大型经济真菌共计163种的脂溶性成分信息及其GC-MS谱图。

综合信息库：为了对菌物资源进行高效地研究与利用，采用Microsoft Office Access数据库系统，建立菌物资源的综合信息库，包含有3 034份标本的基础信息，如照片、采集地地理位置（经度、纬度、海拔）和林型等。

3 讨论

从α多样性分析结果可知， A区和C区物种丰富，这与A区和C区的地理条件有关，此类区域地理条件较好，适宜大型真菌生长。因D区地处北方，靠近干旱地区，生态环境较为恶劣，所以物种丰富度相对较低。同时D区多为针叶林和灌木等植被，这与马敖的大型真菌与不同植物群落的多样性分析结果相似，灌木、草丛中大型真菌物种丰富度相对较小，但均匀度较高。本研究中列举的可利用的大型经济真菌资源包含有食用菌、药用菌和有毒真菌，这3类真菌与人们生活最为贴近，因为大部分大型真菌的化学成分和药理作用研究不够深入与透彻，所以保护区内的大型经济真菌资源还有待人们的探索与发现。本研究提供的数据可作为后续学者对食药用菌进行驯化栽培、培育品种、对有毒真菌进行化合物分析及毒素提取等相关研究的基础。同时大型经济真菌也可以用于发展地方特色产品，提升地方经济发展。

初步构建祁连山国家级自然保护区大型真菌的菌种库、菌体库、基因库、化合物库和综合信息库是对该地区的大型真菌资源进行保护的一种措施，相较于李玉院士团队在西藏地区所建立的五库系统仍有较多不足，期望今后学者对祁连山国家级自然保护区大型真菌的五库系统不断进行完善。