长白山地区蜜环菌属真菌资源

东营菌物科学 2024-05-15 发布于山东

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朱艳，杨非一，吕孟洁，袁雪艳，HSIANG Tom，刘淑艳

1. 吉林农业大学植物保护学院，长春 130118；2. 吉林农业大学菌物学院，长春 130118；3. 食药用菌教育部工程研究中心，长春 130118；4. 圭尔夫大学环境科学学院，圭尔夫市 3227

摘要蜜环菌属Armillaria真菌是长白山地区代表性野生菌，具有重要的食药用价值。本研究采用样方调查和随机踏查相结合的方法对该地区蜜环菌属物种展开资源调查和种类鉴定，结果表明，长白山地区蜜环菌有5种，即北方蜜环菌Armillaira borealis、法国蜜环菌A. gallica、黄小蜜环菌A. cepistipes、芥黄蜜环菌A. sinapina以及Armillaira sp.，其中北方蜜环菌为吉林省新记录种，法国蜜环菌为该地区的优势物种。多样性分析结果表明，在阔叶林、针阔混交林、针叶林3种林型中，针阔混交林中蜜环菌属α多样性指数相对较高，说明针阔混交林的物种丰富度最高。本研究为蜜环菌属资源的开发和利用提供理论基础和实践依据。

关键词蜜环菌属；物种多样性；长白山

蜜环菌属Armillaria（Fr.：Fr.）Staude隶属于担子菌门Basidiomycota、蘑菇纲Agaricomycetes、蘑菇目Agaricales、泡头菌科Physalacriaceae，是一种分布广、适应性强的食药用菌，同时也是一类寄主广泛、易导致木本和草本植物感病的重要病原菌。蜜环菌的属名在1982年被正式命名为Armillaria（Fr.：Fr.）Staude。我国蜜环菌的研究始于1963年，邓叔群采用Armillaria为属名，按照形态特征鉴定了中国6个蜜环菌属物种。据文献报道，全球已知的蜜环菌属物种有40~50种。我国报道了14种，东北地区报道的蜜环菌有5种。交互不育现象（即生物种）的发现促进了全球对蜜环菌属真菌的研究，但是该方法在蜜环菌属的鉴定中存在很大的局限性。相比基于形态学及生物种方法鉴定蜜环菌，分子生物学方法在灵敏度、精确度、易操作性等方面具有很大的优势。Guo等采用ITS、tef1-α、β-tubulin单基因序列及联合多基因序列构建系统发育树，初步研究了我国蜜环菌潜在的系统发育谱系。Klopfenstein等提出 tef1-α基因是研究蜜环菌属系统发育关系和物种鉴定的有效分子片段。

长白山地区生态环境优良，森林资源丰富，以多年生木本植物为主，其独特的生物结构和地段类型构成了典型的生态环境，同时其环境承载能力较强，是同纬度原始森林中保存最为完整的地区。蜜环菌是东北地区重要的野生食药用菌，民间早有采集其子实体食用和治疗疾病的传统，作为大宗食用菌，它是当地人重要的经济来源。但目前长白山地区蜜环菌属真菌的资源分布尚不明确，缺乏对该地区蜜环菌的系统研究，这使得蜜环菌属真菌的利用和开发停滞在初始阶段。传统的采摘不能提升蜜环菌属真菌的经济效益，还可能因为过度采收和不合理开发而导致蜜环菌属真菌资源遭到严重破坏。因此本文对长白山地区蜜环菌属物种开展了资源调查，以期为蜜环菌属资源的开发和研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 野外调查与标本采集

于2020‒2021年的8月至9月，以每周2次的频率，通过样方调查和随机踏查在吉林省白山市、通化市、吉林市和延边朝鲜族自治州4个地区的林区进行野外调查，并统计每个林型中获得的标本数（相同林型下不同样方标本数的总和），以用来分析不同林型下蜜环菌属的物种多样性指数。随机踏查地点为上述4个地区的周边林区。样方设置在上述4个地区的不同植被类型中：

（1）阔叶林型（样方编号B1，B2，B3，B4）。地理位置为分别为127°52'20' E，42°07'71' N；126°15'07' E，41°64'53' N；128°09'91' E，42°37'87' N；126°75'34' E，42°72'22' N。主要树种为蒙古栎Quercus mongolica Fischer ex Ledebour 、大青杨Populus ussuriensis Kom.、白桦Betula platyphylla Suk、山杨Populus davidiana Dode、紫椴Tilia amurensis Rupr.等。

（2）针叶林型（样方编号C1，C2，C3，C4），地理位置分别为127°86'15' E，42°48'76' N；126°15'08' E，41°64'52' N；128°07'33' E，42°09'12' N；126°75'36' E，42°72'25' N。主要树种为长白落叶松Larix olgensis Henry、臭冷杉Abies nephrolepis（Trautv.）Maxim.等。

（3）针阔混交林型（样方编号M1，M2，M3，M4），地理位置分别为127°53'19' E，42°31'61' N；126°15'08' E，41°64'54' N；127°92'04' E，41°90'37' N；126°75'33' E，42°72'27' N。主要树种为元宝槭Acer truncatum Bunge、蒙古栎Quercus mongolica Fischer ex Ledebour、水曲柳Fraxinus mandschurica Rupr.等。

1.2 形态学观察

宏观形态观察：野外采集时观察和记录菌盖、菌环和菌柄的形状、颜色及其表面是否具附属物及子实体生境等特征，并测量子实体的菌盖、菌柄直径和长度。

微观形态观察：选取干净完整的子实体作为显微观察材料，使用75%酒精消毒的镊子或刀片对菌褶进行取样切片，并置于5% KOH溶液的载玻片上，滴加1%刚果红溶液进行染色，盖上盖玻片。将玻片置于显微镜下，观察担子、担孢子、不育担子、锁状联合等结构，并用ZEN软件测量和记录上述各结构的尺寸。

1.3 分子系统学研究

1.3.1 DNA提取

取100 mg烘干的菌褶置于2 mL离心管中，加入3 mm直径研磨钢珠4粒，经液氮冷冻8~10 min后置于组织研磨仪中研磨30 s。采用Hi-DNA Secure Plant Kit DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

1.3.2 引物设计

从NCBI数据库中下载蜜环菌属物种的tef1- α序列，采用SeqMan软件进行序列比对，找到包含多个变异位点的区域作为引物设计起始位点区间。利用在线网站Primer-BLAST及软件Primer Premier依据来自美国W113菌株（GenBank ID：JF313115）的序列设计新引物，引物序列如下：EF1-335-F（5′-CGCTGGTGGAACT GGTGAG-3′）/EF1-3115-R（5′-AGGGTGGTTGA GGATGATGAC- 3′）。

1.3.3 PCR扩增

PCR反应体系及条件，10×Buffer（Mg²⁺）2.5 µL，dNTP（2.5 mmol/L）2 µL，引物1（10 pmol/µL）1 µL，引物2（10 pmol/µL）1 µL，Taq 酶（0.2 U/µL）0.1 µL，DNA模板1 µL，ddH₂O 15.4 µL。PCR反应参数具体如下：95 ℃ 预变性3 min；94 ℃ 变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸40 s，以上3个步骤重复33个循环；72 ℃后延伸7~10 min。将经电泳检测合格的PCR产物（检测条带清晰明亮）送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。获得的序列上传至NCBI数据库，基因序列号为ON375568~ON3755676。

1.3.4 系统发育树构建

使用BioEdit软件查看序列峰值图，通过比较正反序列峰值图的序列位点，进行人工校对，并用DNAMAN软件对获得的原始序列进行拼接。使用MEGA7.0软件对所有序列进行多重序列比对。从5个蜜环菌属物种中挑选具有代表性的标本序列（红色标记），同时从NCBI下载了43条tef1-α序列，以Desarmillaria tabescens、D. ectypa为外群，使用PAUP4.0和MrBayes3.1.6进行最大似然法（Maximum likelihood，ML）分析，采用自展法进行1 000 次重复以评估各分支的支持率，系统树的支持率仅显示高于60%的数值（“*”标注为本研究提供的序列）；贝叶斯可靠性估计值高于90%的在各分支显示。

1.4 物种多样性分析

通过α多样性指数分析3种林型中蜜环菌的生物多样性，α多样性分析包含5个指数：Simpson 指数（D_SW）：D_SW=1‒Σ（Pi）²；Shannon-wiener 指数（H’）：H'=‒ΣPiln（Pi）；Pielou 均匀度指数（E）：E=H'/ln（S）；Margalef 丰富度指数（R1）：R1=（S-1）/ln（N）；Menhinick 丰富度指数（R2）：R2=S/

。式中，S为种i所在样方的物种总数；N为样方内大型真菌的总个体数；Pi为种i的个体数与总个体数之比。

2 结果与分析

2.1 资源调查结果

2020‒2021年，在吉林省白山市、通化市、吉林市和延边朝鲜族自治州4个地区，通过样方调查和随机踏查共获得蜜环菌属标本132份（表1）。标本保藏在吉林农业大学菌物标本馆（FJAU），馆藏标本号为FJAU60494~60580，FJAU60977~61022。

表1 长白山地区蜜环菌属物种的地理分布Table 1 Geographical distribution of Armillaria species in the Changbai Mountain

2.2 物种鉴定结果

对长白山地区蜜环菌属标本宏观和微观形态进行了描述，并挑选每个物种的代表性标本序列与从NCBI下载的已知种序列基于tef1-α序列构建系统发育树（图1）。通过分子生物学特征与形态学特征相互佐证，共鉴定出5个物种，分别为北方蜜环菌A. borealis、芥黄蜜环菌A. sinapina、法国蜜环菌A. gallica、黄小蜜环菌A. cepistipes、Armillaria sp.。

图1 基于tef1-α基因采用最大似然法（ML）和贝叶斯法（BI）构建的蜜环菌属系统发育树Fig. 1 Phylogenetic tree of Armillaria constructed on the basis of tef1-α sequences by using the maximum likelihood (ML) and Bayesian (BI) methods

2.2.1 北方蜜环菌

Armillaria borealis Marxm. & Korhonen， in Marxmüller， Bull. Trimest. Soc. mycol. Fr. 98（1）：122 （1982）。

子实体中等至较大。菌盖直径3~10 cm，初期半球形、扁球形，幼时边缘内卷，后期扁平，成熟后菌盖凸起呈深色环带，表面黄褐色至浅黄褐色，有时橄榄色，中部深棕色，稍凸，具有短而直立的棕色纤毛，鳞片稀少，后期近光滑，干燥时边缘变白；菌肉白色，质地坚硬，灰褐色；菌褶直生或延生，密，不等长，幼时白色至粉红色，成熟后红褐色；菌柄0.5~1.5×5~13 cm，圆柱形，基部明显膨大，上部色浅，菌环下部浅黄色或粉黄色，具白色绒毛或纤毛状鳞片，内部松软，鳞片由菌环向基部逐渐变小。孢子印是淡奶油色。担孢子6~9×4.5~5.0 µm，宽椭圆形，带细尖，光滑，淀粉质。担子30.1~43.4×5.7~8.1 µm，具4个小梗，棍棒状，基部有锁状联合（图2）。

图2 北方蜜环菌子实体及显微形态特征Fig. 2 Fruiting body and micromorphological characteristics of Armillaria borealis

a. 子实体 Fruiting body；b‒f. 担子及担孢子 Basidium and basidiospore

获得的该种tef-1序列（GenBank号：ON375576）在系统发育树上与已报道的北方蜜环菌A. borealis（GenBank号：MW418602、FJ618642）聚在一个分支，支持率ML/BI=90/0.99（图1）。

凭证标本：FJAU60494（GenBank号：ON375576），采集自吉林省白山市抚松县长白山国家级自然保护区。该种其他馆藏标本号：FJAU60495~60497。

寄主：山杨Populus davidiana。

生境：枯树和活树。

寄生性：具有弱寄生性。

国内分布：湖北神农架和陕西太白山地区和吉林省。

世界分布：挪威、瑞典、芬兰、中国。

2.2.2 芥黄蜜环菌

Armillaria sinapina Bérubé & Dessur.， Can. J. Bot. 66（10）：2030 （1988）。

子实体单生至丛生。菌盖直径2~6 cm，圆锥形、钟形，幼时凸，成熟后平凸，偶见乳头状，无黏性，边缘直，有时具条纹，菌盖白色至奶油色，有膜状的白色斑块；肉质紧实，边缘渐薄，鳞片纤维状，棕色，不易脱落；菌褶延生，奶油色至肉桂色，稍具条纹；菌柄0.5~1.0×4~8 cm，棍棒状，纤维质；菌环黄色，纤维状，膜质，薄且脆弱，成熟后贴伏于菌柄上。担孢子8.5~10.0×5.2~7.0 µm，宽椭圆形到卵形，光滑，具细尖，非淀粉质。担子棍棒状，25.3~39.4×5.6~8.6 µm，具4个孢子梗；具锁状联合（图3）。获得的该种tef-1序列（GenBank号：ON375572和ON375573）在系统发育树上与已报道的芥黄蜜环菌A. sinapina的序列（GenBank号：KT822422、KT822423、KT822424）聚在一支，支持率ML/BI=99/0.99（图1）。

图3 芥黄蜜环菌子实体及显微形态特征Fig. 3 Fruiting body and micromorphological characteristics of Armillaria sinapina

a. 子实体 Fruiting body；b‒f. 担子及担孢子 Basidium and basidiospore

凭证标本：FJAU60988（GenBank号：ON375572）和FJAU60989（GenBank号：ON375573），均采集自吉林省延边朝鲜自治州安图县。

寄主：白桦Betula platyphylla、蒙古栎Quercus mongolica。

生境：该种可寄生在活的岳桦上。

寄生性：弱寄生菌。

国内分布：黑龙江、吉林长白山、小兴安岭和大兴安岭地区、内蒙古。

世界分布：日本、北美、中国吉林等地。

2.2.3 法国蜜环菌

Armillaria gallica Marxm. & Romagn.， in Boidin， Gilles & Lanquetin， Bull. trimest. Soc. mycol. Fr. 103（2）：152 （1987）。

子实体单生或群生，菌盖直径3~10 cm，凸起、锥形至平展，潮湿时呈棕黄至棕色，中心颜色较深，干燥时中心颜色变浅，菌盖表面有细纤毛；菌褶直生或延生，幼时白色，成熟后粉红色至褐色；菌柄1~3×4~10 cm，棒状，基部膨大。菌环上部为浅橙色到棕色；菌环下部白色或浅粉红色，基部为灰棕色。菌环近顶生，有时白色至奶油色。孢子印呈白色。孢子表面光滑，椭圆形，具有突出的细尖，淀粉质，常常含有油滴。担子5.7~9.2×3.6~6.3 µm，球棒形，基部具有锁状联合（图4）。

图4 法国蜜环菌子实体及显微形态特征Fig. 4 Fruiting body and micromorphological characteristics of Armillaria gallica

a.子实体Fruiting body；b.锁状联合 Clamp connection；c‒g. 担子及担孢子 Basidium and basidiospore

获得的该种tef-1序列（GenBank号：ON375570和ON375571）在系统发育树上与已报道的法国蜜环菌A. gallica序列（GenBank号：KT822402）聚在一支，支持率ML/BI=90/0.94（图1）。

凭证标本：FJAU60533（GenBank号：ON375570），吉林省延边朝鲜自治州敦化市；FJAU60534（GenBank号：ON375571），吉林省延边朝鲜族自治州图们市。该种其他凭证标本号：FJAU60535~60580，FJAU60977~60987。

寄主：云杉Picea asperata、蒙古栎Quercus mongolica等。

生境：主要表现腐生性，在死树中生长。

国内分布：长白山和小兴安岭地区。

世界分布：中国、日本、北美和欧洲均有分布。

2.2.4 黄小蜜环菌

Armillaria cepistipes Velen. ［as 'cepaestipes'］， České Houby （Praze） 2：283 （1920）。

子实体较大。菌盖直径4~15 cm，初期半球形，后菌盖平展至扁平，浅黄褐色或红褐色，菌盖中央颜色较深，水浸状，边缘内卷且有膜质的白色菌幕残余，边缘近白色，幼时有成簇的暗褐色毛状鳞片，成熟后边缘上翘有条纹，湿时水浸状，具纤毛，后变光滑；菌肉污白色或变深；菌褶白色，直生或延生，较密，不等长；菌柄长0.5~1.3×5~12 cm，中生，近圆柱形，上部污白色，下部颜色稍深，有白色或浅黄色鳞片，基部膨大；菌环黄色丝膜状，后留有残迹。担孢子表面光滑，6.3~8.4×5.0~6.5 μm，椭圆形至长椭圆形，非淀粉质。担子30.3~39.3× 6.7~9.1 μm，棒状，具2~4小梗，锁状联合多见于担子基部及菌髓层中（图5）。该种获得的tef-1序列（GenBank号：ON375568）在系统发育树上与已报道的黄小蜜环菌A. cepistipes序列（GenBank号：KT822416）聚在一支，支持率ML/BI=80/1（图1）。

图5 黄小蜜环菌子实体及显微形态特征Fig. 5 Fruiting body and micromorphological characteristics of Armillaria cepistipes

a. 子实体 Fruiting body；b‒e. 担孢子及担子Basidiospore and basidium

凭证标本：FJAU60498（GenBank号：ON375568），吉林省白山市抚松县。该种其他馆藏标本：FJAU60499~60533。

寄主：云杉Picea asperata、山杨Populus davidiana、白桦Betula platyphylla等。

生境：阔叶林。

国内分布：吉林、辽宁。

世界分布：中国、欧洲（挪威）、捷克共和国。

2.2.5 Armillaria sp.

菌盖直径1.5~8.0 cm，幼时半球形，成熟后平展至凸镜型，或稍凹陷。菌盖边缘整齐，边缘稍内卷，具条纹。幼时菌盖颜色为金黄色，中央黄褐色，成熟后为褐色，具褐色至黑褐色鳞片；菌肉白色；菌褶延生，不等长，幼时污白色，后呈褐色；菌柄中生，圆柱形，基部膨大，菌环上部白色，菌环下部黄褐色。幼时菌环米白色，膜质，成熟的子实体菌幕残余较少。孢子印白色。担孢子4.9~10.3×3.6~7.4 μm，广椭圆形至近卵形，光滑，非淀粉质。担子25.2~40.3×5.8~9.1 μm，棍棒状，无隔膜，2~4小梗（图6）。该种获得的tef-1序列（GenBank号：ON375574、ON375575）在系统发育树上与Armillaria sp.序列（GenBank号：KT822364）构成一支，支持率ML/BI=91/0.99（图1）。

图6 Armillaria sp.子实体及显微形态特征Fig. 6 Fruiting body and micromorphological characteristics of Armillaria sp.

a. 菌盖Fruiting body；b. 菌褶及菌柄 Gill and stipe；c‒f. 担子及担孢子 Basidium and basidiospore

凭证标本：FJAU60991（GenBank号：ON375574）和FJAU60992（GenBank号：ON375575），均采集自吉林省白山市抚松县松江河国家森林公园。该种其他馆藏标本：FJAU60993~60996。

寄主：云杉 Picea asperata。

生境：阔叶林。

致病性：弱致病性。

国内分布：长白山和小兴安岭地区。

世界分布：中国。

2.3 蜜环菌在长白山地区的地理分布

通过对长白山地区蜜环菌属进行优势种群和分布规律分析可知，延边朝鲜族自治州的蜜环菌属最丰富，包括5个物种。吉林市和通化市物种丰富度较低，均为2个物种（法国蜜环菌和黄小蜜环菌）。整体来看，长白山东部地区的蜜环菌物种丰富度高于西部地区（表1）。法国蜜环菌是长白山地区蜜环菌属真菌的优势物种，其次是黄小蜜环菌，芥黄蜜环菌是该地区分布最少的物种。

2.4 蜜环菌的物种多样性

对不同林型（阔叶林型、针叶林型、针阔混交林型）的蜜环菌进行α多样性指数分析，发现蜜环菌在不同林型的多样性分布有所差异，针阔混交林中物种丰富度高于其他两种林型。其中Simpson指数，针阔混交林（0.61）>阔叶林（0.55）>针叶林（0.53）。Shannon-wiener指数，针阔混交林（1.14）>针叶林（1.01）>阔叶林（0.87），说明针阔混交林物种多样性相对较高；Pielou均匀度指数，阔叶林（0.79）>针叶林（0.73）>针阔混交林（0.71），说明在阔叶林中蜜环菌属不同物种数量分布相对均匀；丰富度指数变化趋势一致：针阔混交林（R1=0.86，R2=0.48）>针叶林（R1=0.64，R2=0.39）>阔叶林（R1=0.43，R2=0.29）。上述结果说明针阔混交林型中蜜环菌属物种最丰富，可见针阔混交林最适合蜜环菌子实体的生长。

3 讨论

本研究通过对长白山地区蜜环菌物种界定和资源调查，明确了该地区蜜环菌的种类及分布特征。通过本研究发现，长白山地区蜜环菌物种数为5种，分别为：北方蜜环菌、法国蜜环菌、黄小蜜环菌、芥黄蜜环菌、Armillaira sp.，其中北方蜜环菌为吉林省新记录种，生于山杨树干底部，该种曾报道分布于湖北神农架和陕西太白山地区，其子实体可生长在枯树和活树上，寄主详情未知。本研究尚未发现已报道物种奥氏蜜环菌，赵俊等记录了该种于9月下旬后出现子实体，分布在长白山、小兴安岭和大兴安岭地区。笔者未发现该种可能与采样频率或采集时间有关。

准确鉴定蜜环菌，能为合理开发和利用蜜环菌属资源提供理论依据。在过去很长一段时间，依据形态特征是鉴定该属物种的主要方法。蜜环菌属中某些物种形态高度相似，如法国蜜环菌和黄小蜜环菌。生物种概念的出现加速了蜜环菌的研究，前人对长白山地区蜜环菌的研究主要基于形态学和生物种的界定。该属内物种的ITS序列在种间表现出高度相似性，难以有效区分不同物种。本研究基于tef1-α基因构建了系统发育树，佐证了形态学鉴定结果，说明tef1-α基因可作为有效鉴定蜜环菌属物种的分子片段，该结果与Klopfenstein和Maphsosa等研究结果一致。蜜环菌属物种的鉴定要结合形态及分子系统学等数据，必要时还需结合交互不育现象进行界定，如本文中待定种Armillaria sp.在系统发育树中与中国蜜环菌生物种CBS C相近，说明该物种与CBS C亲缘关系较近，但该种是否可以归属于CBS C，需要结合交互不育试验及形态等特征，才能将其归属为CBS中。

本研究在对长白山地区蜜环菌属真菌进行资源调查的基础上，澄清了长白山地区的蜜环菌属的物种组成及种群的分布规律。笔者发现蜜环菌属真菌在长白山地区广泛分布，在延边朝鲜族自治州的蜜环菌属物种较丰富，吉林市和通化市的蜜环菌属物种丰富度较低，该结果可能与采样时间有关。长白山地区的优势蜜环菌为法国蜜环菌，其次是黄小蜜环菌。整体来看，长白山东部地区相比于西部地区具有更多的蜜环菌属物种数。图力古尔等和王耀等对长白山地区不同林型中大型真菌多样性进行分析，发现蜜环菌A. mellea（Vahl）P.Kumm.和奥氏蜜环菌A. ostoyae（Romagn.）Herink这2个物种不仅生长于针阔混交林中，也在针叶林中生长，说明蜜环菌的生境具有多样性。本研究通过对长白山地区不同林型中的蜜环菌属真菌α 多样性进行比较，发现针阔混交林的Simpson指数、Shannon-wiener 指数、Margalef指数、Menhinick指数相对较高，这与辛琪等的研究结果一致，表明蜜环菌真菌在针阔混交林中物种组成相对丰富，提示针阔混交林能给蜜环菌属真菌提供更佳的生长环境，不同林型的光照和水分可能在一定程度上影响蜜环菌属子实体的生长。3种植被群落中阔叶林的Pielou均匀度指数最高，物种分布最均匀，物种多样性最低，说明在阔叶林中物种差异较小。本研究补充了该地区菌物资源的数据，可为挖掘和利用该地区蜜环菌属资源提供数据基础。